PCR numérique basée sur une puce dans un tube pour la quantification de variants nucléotidiques uniques

Ajoutez des amorces, des sondes et de l’ADN génomique précédemment conçus à une nouvelle bandelette de 8 tubes, pour atteindre un volume total de 15 microlitres. Pipeter de haut en bas pour mélanger.

Ajoutez la plate-forme de chargement sur les copeaux intégrés dans la nouvelle bande de 8 tubes, puis placez la bande de tubes dans le chargeur automatique. Assurez-vous qu’il y a un contact entre les copeaux et la plate-forme de chargement. Ensuite, placez le curseur de chargement dans la plate-forme et utilisez un butoir pour maintenir le curseur hors du chargeur. Pipetez 15 microlitres du mélange PCR près de l’extrémité du curseur, puis appuyez sur le bouton du chargeur pour faire fonctionner le chargeur pendant 1 minute.

Retirez la bande tubulaire du chargeur après le passage et placez-la dans un activateur d’étanchéité. Poussez avec précaution le couvercle coulissant et le bord du couvercle supérieur. Faites fonctionner l’activateur d’étanchéité pendant environ 2 minutes. Si l’étanchéité est incomplète, indiquée par une flaque de liquide, répétez le passage pendant une minute supplémentaire.

Ajoutez 230 microlitres de liquide d’étanchéité dans les tubes. Placez la bande tubulaire dans le thermocycleur et exécutez la PCR comme décrit dans le protocole. S’il y a une répartition inégale des cloisons positives, ajustez la température ou la durée de la PCR.

Pour détecter et analyser l’intensité de fluorescence des produits de PCR, placez la bande de tube sur le gabarit de détection et ajoutez 6 millilitres d’eau distillée. Éliminez toutes les bulles d’air visibles à l’aide d’une pointe de pipette.

Chargez le gabarit dans le détecteur. Dans le logiciel de détection, sélectionnez les onglets « Fluorescence », « Expérience », puis « Échantillon/NTC », puis cliquez sur le bouton « Exécuter » pour démarrer l’exécution. Une fois l’exécution terminée, confirmez le tracé de position, l’histogramme et le nuage de points 2D.

Pour recueillir le produit PCR, retirez le liquide d’étanchéité du tube. Ajoutez 100 microlitres de tampon TE et agitez vigoureusement pendant 30 secondes. Centrifugez brièvement les tubes dans une centrifugeuse de table, et procédez comme décrit dans le protocole textuel, pour terminer le prélèvement du produit PCR.