Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l'homme

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des biofilms d’aérogène de pseudomonas à la surface apicale de cellules épithéliales vivantes des voies respiratoires humaines. Ceci est accompli en établissant d’abord une monocouche confluente de cellules épithéliales des voies respiratoires sur une surface en plastique ou une lamelle de verre. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver une culture de bactéries p aerogènes de manière constitutive, exprimant la protéine fluorescente verte.

L’étape suivante consiste à mettre les bactéries et les cellules des voies respiratoires en contact les unes avec les autres dans un cadre statique ou dans une chambre d’écoulement. La dernière étape de la procédure consiste à laisser les biofilms bactériens se développer au fil du temps tout en évaluant la viabilité des cellules des voies respiratoires. Des résultats peuvent être obtenus qui montrent la formation de biofilm sur les cellules vivantes des voies respiratoires grâce à la microscopie à fluorescence.

L’implication de cette technique s’étend au traitement des patients atteints de mucoviscidose, car ces modèles de co-culture peuvent être utilisés pour développer et valider de nouveaux schémas antibiotiques, capables d’éradiquer les biofilms responsables de la colonisation chronique des voies respiratoires. Chez les patients atteints de mucoviscidose, le modèle de biofilm de co-culture statique utilise des cellules CFBE, qui sont des voies respiratoires humaines immortalisées. Des cellules épithéliales développées à l’origine à partir d’un individu atteint de fibrose kystique sept à 10 jours avant l’inoculation bactérienne ont ensemencer les cellules CFBE dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.

Nous ensemenceons des cellules à une concentration de deux fois 10 à la cinquième cellules par puits dans 0,5 millilitre de milieu essentiel minimal ou MEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal, deux millimolaires de L-glutamine, 50 unités par millilitre, de la pénicilline et 50 microgrammes par millilitre. La streptomycine fait croître les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 95 %air pendant sept à 10 jours changer de support tous les deux à trois jours.

Ces conditions conduiront à la formation d’une jonction confluente, monocouche et serrée un jour avant l’expérience. Inoculer une culture de cinq millilitres de LB avec du pierro gen à partir d’un stock congelé et faire pousser 18 heures à 37 degrés Celsius sur un rotateur. À 200 tr/min, nous utilisons l’aérogène p porteur du plasmide PSMC 21 pour l’expression constitutive de la GFP le jour de l’inoculation bactérienne.

Retirer le milieu des cellules CFPE et ajouter un volume égal de milieu de microscopie, qui est du MEM sans rouge de phénol, complété par deux confluences millimolaires d’inoculation de L-glutamine, des monocouches CFBE avec posa à une multiplicité d’infection d’environ 30 à un par rapport au nombre de cellules CFBE initialement ensemencées pour une plaque de 24 puits. Cela équivaut à 1,2 fois 10 de la septième UFC par millilitre dans 0,5 millilitre de MEM par. Bien incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, 95 % d’air pendant une heure.

Après l’incubation d’une heure, retirez le piège et remplacez-le par une microscopie fraîche. Milieu complété par 0,4 % d’arginine. L’ajout d’arginine retarde la destruction de la monocouche suffisamment longtemps pour que des biofilms se forment sur les cellules CFPE.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, 95 % d’air pendant différents points de temps jusqu’à environ huit heures toutes les deux heures. Analysez l’intégrité de la monocouche CFBE et la croissance du biofilm à l’aide de la microscopie. Le modèle de biofilm de co-culture de cellules en flux nécessite la formation d’une monocouche confluente de cellules CFBE sur une lamelle de verre de 40 millimètres de diamètre.

Pour ce faire, placez d’abord un couvercle stérile glissé dans un plat en plastique stérile de 60 millimètres de diamètre. Ajoutez ensuite trois millilitres de croissance cellulaire préchauffée, en appuyant moyennement sur la lamelle avec la pointe de la pipette pour éliminer toutes les bulles piégées en dessous, et pour forcer la lamelle au fond de la graine de la parabole en plastique, deux fois 10 à la sixième cellules CFBE par boîte. Secouez doucement le plat d’avant en arrière, mais évitez de tourbillonner pour éviter de centrifuger les cellules contre les côtés du plat.

Placez le plat dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 95 % d’air à 37 degrés Celsius pendant huit à 10 jours. Nourrissez les cellules tous les deux jours avec trois millilitres de milieu de croissance frais. Dans ces conditions, les cellules formeront une monocouche confluente sur la lamelle de verre.

L’étape suivante consiste à préparer la souche bactérienne P aerogen un jour avant l’expérience. Cultivez p aérogène dans cinq millilitres de LB pendant 18 heures à 37 degrés Celsius sur un rotateur. À 200 tr/min, nous utilisons la souche aérogène P, PO un, portant le plasmide PSM C 21 pour l’expression constitutive de la GFP le jour de l’expérience.

À un millilitre de culture bactérienne dans un microtube de centrifugation stérile et centrifuger à 6 000 tr/min pendant trois minutes. Lavez la pastille bactérienne deux fois dans un millilitre de microscopie. Dilution moyenne de 0,5 millilitre de bactéries lavées et remises en suspension dans 4,5 millilitres de milieu de microscopie pour atteindre une concentration d’environ cinq fois 10 des huitièmes UFC par millilitre.

Nous sommes maintenant prêts à observer les cellules CFPE en temps réel, ce qui nécessite une chambre d’imagerie couplée à une pompe péristaltique pour assurer un flux de nutriments pendant de longues périodes. Et un contrôleur de température, nous utilisons un appareil standard de cellule d’écoulement de biofilm. Les biotechs FCS à deux chambres modifiées pour accueillir des cellules CFPE.

L’une des étapes les plus critiques du modèle de biofilm de co-culture de cellules en flux consiste à assembler la chambre sans endommager le moniteur de cellule pour assembler la chambre. Tenez la moitié supérieure de la chambre à l’envers de manière à ce que les tubes de perfusion soient visibles et alignez les trous de dégagement d’un joint en caoutchouc de 0,75 millimètre d’épaisseur sur les tubes de perfusion. Empilez la glissière du micro-aqueduc fournie avec la chambre sur le joint en caoutchouc, en vous assurant que le côté rainuré est vers le haut.

Placez ensuite un autre joint en caoutchouc sur le dessus de la glissière. L’épaisseur et la géométrie interne de ce second joint détermineront le volume de la chambre. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de microscopie préchauffé au centre de la lame.

Placez la chambre d’imagerie sur une surface stérile pendant que vous récupérez les cellules CFPE de l’incubateur de culture cellulaire. Retirez le milieu usagé de la vaisselle et lavez une fois les cellules CFPE avec trois millilitres de milieu de microscopie préchauffé. À l’aide d’une pince lavée à l’éthanol.

Récupérez la lamelle de la coupelle et abaissez-la à l’envers sur la perle de support de microscopie placée sur la chambre. La lamelle repose maintenant sur le deuxième joint en caoutchouc et la monocouche de cellules des voies respiratoires est orientée vers le bas. En tenant les composants assemblés d’une main, placez la base de la chambre sur le dessus de la pile et retournez rapidement la chambre pour que tout soit à l’endroit.

Verrouillez la base en place en tournant l’anneau. Connectez le tube d’entrée à la pompe de microperfusion à faible débit. Un deuxième morceau de tube relie la pompe à une quantité de milieu de microscopie placée dans le bain d’eau à 37 degrés Celsius.

Situé juste à côté du microscope. Démarrez le débit à un rythme de 20 millilitres par heure. Ce débit est dans la capacité de vitesse de nage de posa.

Fixez un tube stérile prédécoupé d’une 16e CFL aux tubes de perfusion d’entrée et de sortie de la chambre, puis connectez le régulateur de température. Placez la chambre assemblée sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée. À l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre.

Injectez la suspension bactérienne préalablement préparée dans la chambre à l’aide d’une valve à deux voies placée en ligne entre la pompe et la chambre pour permettre aux bactéries de se fixer aux cellules des voies respiratoires. Arrêtez la pompe pendant deux heures. Après deux heures, le débit peut être relancé et maintenu à 20 millilitres par heure.

Pour le reste de l’expérience, surveiller l’intégrité des cellules des voies respiratoires par interférence différentielle. Microscopie de contraste tout au long de l’expérience pour vérifier les signes d’endommagement de la monocouche. Suivre simultanément le développement de biofilms d’aérogènes p marqués à la GFP à la surface apicale des cellules des voies respiratoires.

En acquérant des images à l’aide d’un microscope confocal inversé ou à fluorescence à champ large dans les essais statiques et les essais sur cellule d’écoulement, il a été constaté que la monocouche CFPE pouvait résister à la présence de p aerogène jusqu’à huit heures après l’inoculation sans aucun signe d’altération. L’intégrité de la monocouche épithéliale peut être évaluée par microscopie à contraste de phase à l’aide d’un inversé, comme le montre cet exemple d’une monocouche confluente de cellules CFPE cultivées sur des plaques de culture tissulaire. Au fil du temps, l’aérogène p produira des toxines et des facteurs de virulence qui peuvent endommager la monocouche de cellules épithéliales entièrement ou en sections.

Dans cet exemple d’une monocouche CFPE compromise, les bactéries P aerogen montrées en vert se propagent entre les jonctions serrées des cellules épithéliales et accèdent aux membranes basolatérales. La formation d’un biofilm n’est généralement pas obtenue dans ces conditions en raison de la détérioration de la monocouche. Cette image montre un biofilm d’aérogène p envahi par la végétation observé 24 heures après l’inoculation après avoir réussi à soutenir la formation du biofilm.

La monocouche CFPE a été endommagée de manière irréparable et est maintenant pratiquement absente. Un biofilm résiduel se développant sous la forme d’une couche plate de bactéries se fixant à la lamelle de verre. Lorsque l’intégrité de la monocouche des voies respiratoires n’est pas compromise.

Les biofilms de l’aérogène P peuvent se former et se développer avec succès à la surface apicale des cellules des voies respiratoires dans les deux modèles de co-culture. Voici une image représentative d’un biofilm d’aérogène exprimant une GFP cultivée sur une monocouche confluente de cellules CFPE à l’aide du modèle de biofilm de co-culture statique évalué par microscopie à fluorescence épiscopale. L’image est une superposition du canal de contraste du visage et du canal de fluorescence.

L’image suivante montre un GFP marqué p aerogène. Biofilm cultivé pendant six heures sur une monocouche confluente de cellules CFBE à l’aide du modèle de biofilm de co-culture de cellules en flux pour faciliter la visualisation des voies respiratoires. Les noyaux monocouches ont été colorés avec HEXT 3 33 42 avant l’inoculation avec posa et apparaissent de couleur bleue.

Les films se présentant sous forme d’amas verts attachés à la surface apicale des cellules CFPE sont dispersés à travers les cellules des voies respiratoires. Les structures typiques en forme de champignon de biofilms d’aérogènes vieux de six heures se formant sur une monocouche de cellules A-C-F-P-E après reconstruction 3D sont montrées ici. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et de visualiser avec succès des biofilms bactériens sur une monocouche établie de cellules des voies respiratoires à l’aide des modèles de co-culture décrits ici, et couplés à des méthodes microbiologiques standard et à la microscopie à fluorescence.