Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

Le but de cette procédure est d’exprimer des récepteurs fonctionnels des lymphocytes T spécifiques de l’antigène sur les lymphocytes T de souris. Tout d’abord, transfectez une lignée cellulaire productrice de rétroviraux avec un plasmide contenant le gène TCR d’intérêt pour emballer le rétrovirus exprimant le TCR. Ensuite, isolez et purifiez les lymphocytes T de la rate de souris et infectez ces lymphocytes T purifiés avec le rétrovirus produit dans la première étape.

Enfin, élargissez les cellules T transduites pour exprimer et obtenir des niveaux appréciables de récepteur. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’expression de TCR fonctionnels spécifiques de l’antigène sur les lymphocytes T de souris par cytométrie en flux. Bonjour, je m’appelle Michelle Crow Guard.

Je suis à l’Institut du cancer de l’Université de New York à la faculté de médecine de l’Université de New York. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment transduire des lymphocytes T primaires, les personnes qui vous montreront comment le faire seront shiong, un post-doctorant dans le laboratoire, Kaleena Melek, une étudiante diplômée dans le laboratoire, et Arian Perez Garcia, un post-doctorant dans le laboratoire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les souris transgéniques est qu’elle prend beaucoup moins de temps.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions immunologiques clés telles que le TCR peut donner une meilleure réponse contre les antigènes. Cette technique peut être appliquée à la thérapie adoptive de transfert de lymphocytes T, qui s’est avérée prometteuse pour le traitement des patients atteints de cancer et consiste en la modification in vitro des lymphocytes T humains pour assurer l’expression égale des chaînes alpha et bêta des récepteurs des lymphocytes T. Sous-clonez le gène d’intérêt dans le même vecteur rétroviral sous le contrôle du même promoteur.

Préparez de l’ADN plasma de haute qualité à l’aide du kit de préparation Kyogen Maxi et faites un stock d’un microgramme par microlitre. Retirez le support de la plaque avec les cellules d’emballage rétroviral E en platine et lavez la plaque une fois avec un XPBS. Délogez les cellules en ajoutant de la trypsine EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant quelques minutes.

Neutralisez les cellules délogées avec un support DMEM et transférez-les dans un tube de faucon. Ensuite, centrifugez les cellules à 1000 fois G pendant cinq minutes. Aspirez le supinate et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu DMEM.

Déterminez le nombre de cellules et diluez les cellules à 0,6 fois 10 à six par plaque de millilitre. 10 millilitres de suspension cellulaire dans une plaque de culture de tissus recouverte de polylysine de 10 millimètres et cultivez-les pendant la nuit dans un incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, examinez les cellules au microscope optique pour vérifier qu’elles sont à environ 80 % de fluidité.

Retirez délicatement le support de la plaque. Lavez les cellules une fois avec un XPBS et ajoutez 10 millilitres de milieu DMEM frais préchauffé sans pénicilline ni streptomycine. Pour le complexe de transfection moyenne labiale, préparez deux mélanges et l’opti ME M1 d’ADN et l’autre de réactif de lipectomie s’équilibrent séparément pendant cinq minutes à température ambiante.

Mélangez ensuite délicatement et laissez incuber pendant 20 minutes. À température ambiante, versez lentement le mélange dans les cellules E en platine. Balancez doucement la plaque d’avant en arrière pour répartir uniformément le mélange de transfection.

Ensuite, incubez des cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur de cellules. Après six à huit heures, remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu DMEM frais pour la production virale. Récoltez une rate de souris et transférez-la dans un milieu RPMI.

Placez la rate dans une passoire cellulaire. Écrasez la rate avec un piston de seringue dans une plaque de culture tissulaire de cinq centimètres. Rincez les cellules de la passoire cellulaire avec du PBS stérile afin de récolter les cellules centrifuger à 1000 fois G pendant cinq minutes.

Jetez le supnatant. Continuez en suspendant la pastille cellulaire dans un tampon de lyse CK. En ajoutant deux millilitres par rate, incubez pendant deux minutes.

À température ambiante. Ajouter le milieu RPMI jusqu’à 20 millilitres et centrifuger à 1000 fois G pendant cinq minutes. Enfin, mettez en suspension la pastille cellulaire dans du PBS stérile.

Déterminez le numéro de cellule et centrifugez à 1000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Afin d’activer les lymphocytes T de souris avant la transduction virale, enrobez les plaques d’anticorps activateurs, à savoir anti CD trois epsilon et anti CD 28. Préparez un mélange d’anticorps d’un microgramme par millilitre d’anti-CD, trois epsilon et deux microgrammes par millilitre d’anti-CD 28 dans du PBS stérile, distribuez 250 microlitres du mélange d’anticorps dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire à 24 puits et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Étiquetez magnétiquement les cellules de la rate conformément au manuel du produit. Placez une colonne LS dans le champ magnétique. Appliquez la suspension de cellule étiquetée sur la colonne.

Recueillir le flux à travers le CD de souris enrichi huit plus cellules T. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon et combinez-la avec le soufflage précédent. Coloration des cellules avec des anticorps anti CD trois epsilon et anti CD huit alpha et analyse de la cytométrie en flux.

Ensuite, centrifugez les cellules à 1000 fois G pendant cinq minutes et remettez en suspension la cellule à 1 million de cellules par millilitre dans un milieu RPMI avec un IL humain recombinant deux. Retirez la solution d’anticorps de la plaque d’activation. Rincez bien chaque avec du PBS stérile.

Ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits et placez la plaque à 37 degrés Celsius. 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur de cellules. Après deux jours de production du virus, le milieu dans la plaque cellulaire de platine ESE devrait devenir jaune.

Transférez le supinate viral dans un tube conique de 15 millilitres pour éliminer les débris cellulaires. Centrifugez le surnageant du virus S à 1000 fois G pendant cinq minutes. Transférez soigneusement le supinate de virus dans un nouveau tube.

Laissez un peu de liquide au fond du tube et ne dérangez pas les débris des cellules. Collectez les lymphocytes T activés de la plaque dans un tube conique de 50 millimètres. Déterminez le numéro de cellule.

Conservez certaines cellules dans un tube séparé pour les utiliser comme centrifugeuse de contrôle négatif à 1000 fois G pendant cinq minutes et jetez le natant en décubitus dorsal. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans le décubitus dorsal du virus. Natant à 10 à six cellules par millilitre avec 20 nanogrammes par millilitre d’humain recombinant, l’interleukine deux et 10 microgrammes par millilitre de sulfate de protéine.

Ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits pour le tube de contrôle. Resus. Suspendez les cellules dans le milieu RPMI à la même densité cellulaire avec la même quantité de recombinant humain, d’interleukine deux et de sulfate de protéine. Ajoutez les cellules dans la même plaque.

Enveloppez la plaque avec une centrifugeuse à film plastique pendant 90 minutes à 2000 fois G à 32 degrés Celsius sans pause. Après la centrifugation, retirez le film plastique. Ajoutez un millilitre de milieu RPMI frais avec 20 nanogrammes par millilitre d’interleukine humaine recombinante deux à chacun, remettez bien la plaque dans l’incubateur.

Il est important d’examiner quotidiennement les lymphocytes T transduits. Divisez les cellules dans des proportions de un à trois si nécessaire. Ne laissez pas les cellules proliférer ou laisser le milieu jaunir au sixième ou au septième jour.

Colorer les cellules avec des anticorps et un tétramère du CMH spécifique du TCR afin d’évaluer l’expression du TCR à la surface des lymphocytes T. Utilisez les cellules T de l’UNSD comme contrôle. Ces lymphocytes T transduits sont maintenant prêts pour d’autres applications en aval.

Avant la transduction virale. Il est avantageux d’obtenir des sous-ensembles de lymphocytes T de haute pureté à l’aide de billes magnétiques commerciales pour évaluer le niveau d’expression des TCR sur les lymphocytes T. Des anticorps spécifiques des chaînes alpha ou bêta du TCR peuvent être utilisés.

En règle générale, 30 à 80 % des cellules peuvent exprimer le TCR transduit en fonction des gènes TCR et des titres viraux. Le tétramère du CMH spécifique au TCR peut également être utilisé pour vérifier davantage l’expression fonctionnelle des TCR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules en bon état après cette procédure. D’autres méthodes telles que les tests de cytotoxicité, d’acide ou de libération de cytokines peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la spécificité et la sensibilité du transduce. Les TCR.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être un expert dans la traduction de votre TCR préféré en cellules T primaires. Alors rendez-vous au laboratoire.