Expansion ex vivo des cellules tumorales T-réactive par le moyen de 1/Ionomycin Bryostatine et la chaîne gamma commune cytokines Formulation

Un protocole efficace pour la

Les objectifs de cette expérience sont d’induire l’activation des lymphocytes T par la statine Brios, la mycine ionique one, ainsi que la différenciation des lymphocytes T par les cytokines de la chaîne gamma en commençant par l’isolement des lymphocytes T sensibilisés aux tumeurs de la rate et des ganglions lymphatiques. Ensuite, activez avec brios la statine un et la mycine ionique deux, des mimétiques de signal intracellulaire qui augmentent respectivement l’activité de la protéine kinase C et le calcium intracellulaire. Culture en présence d’IL sept, d’IL 15 et d’IL deux, pour la différenciation et l’expansion des lymphocytes T réactifs à la tumeur.

La puissante combinaison des résultats de l’interféron gamma EISA et du fait que le test de cytotoxicité peut faire la lumière sur la réactivité tumorale des cellules T élargies et offrir des perspectives potentielles pour l’immunothérapie adoptive. Cette méthode d’expansion exvivo des lymphocytes T réactifs à la tumeur peut aider à répondre à des questions clés en immunologie tumorale, telles que le rôle des cytokines d’imagerie gamma courantes dans la différenciation des lymphocytes T réactifs à la tumeur. Et quel est le rôle de chaque phénotype de lymphocytes T, tels que les cellules effectrices, les cellules mémoires effectrices et les cellules mémoires centrales, dans la génération d’une réponse mémoire à long terme contre le cancer.

L’isolation des ganglions lymphatiques et de la rate et la manipulation septique des lymphocytes sont des procédures difficiles à mettre en œuvre, mais peuvent être apprises rapidement. Par l’observation. Les souris femelles transgéniques FVBN 2 0 2 expriment un nouveau transgène inactivé chez le rat sous la régulation du promoteur MMTV et, par conséquent, ont développé un carcinome mammaire spontané entre quatre et 10 mois.

Dans ce protocole, ces souris porteuses spontanées de tumeurs sont utilisées comme donneuses de lymphocytes T réactifs à la tumeur. Pour commencer, isolez la tumeur, drainant les ganglions lymphatiques et la rate de souris transgéniques porteuses de tumeurs FVBN 2, 0, 2. Préparez maintenant une suspension unicellulaire dans du RPMI 1640 glacé complété par 10 % FB sce Une culture à 10 à six cellules par millilitre dans un milieu complet contenant 15 % FBS avec une micromolaire cin cinq nano molaires brios statine un et 80 unités par millilitre.

IL deux pendant 16 heures avec notre milieu PMI équilibré à 37 degrés Celsius, laver les cellules trois fois, puis cultiver à 10 à six cellules par millilitre dans un milieu complet avec 10 nanogrammes par millilitre, chacun de IL sept et IL 15 pendant 24 heures. Afin d’activer davantage les cellules, pulsez avec un ajout de 40 unités par millilitre, il deux pendant 24 heures. Divisez maintenant les cellules et cultivez-les avec 10 nanogrammes par millilitre, chacun de IL sept et IL 15 pendant quatre jours de plus si nécessaire, changez de milieu et divisez les cellules tous les deux jours.

Récoltez les lymphocytes T primaires expansés par centrifugation, dénumérez les cellules par microscopie optique et calculez l’expansion du repliement des lymphocytes T. Préparez maintenant les cellules pour la cytométrie en flux afin de déterminer la proportion de cellules T CD huit positives et DC 4 positives. Bloquez d’abord la liaison non spécifique des anticorps aux récepteurs FC en incubant les cellules avec des anticorps anti CD 16, CD 32 pendant 20 minutes sur de la glace.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS glacé complété par 1 % d’azoture de sodium colorant les cellules en incubant avec des anticorps Fitz CD quatre et PE CD huit pendant 20 minutes sur de la glace. Lavez deux fois avec deux millilitres de PBS glacé complété par 1 % de FBS et 0,1 % d’azoture de sodium. Enfin, fixez les cellules avec 1 % d’aldéhyde paraforme et analysez les échantillons sur un Beckman Coulter FC 500 à l’aide du logiciel Summit version 4.3 dans six plaques de culture de puits, pipette T de cellules avec des cellules tumorales mammaires dans un rapport effecteur/cible de 10 pour un et trois millilitres par puits.

Milieu complet contenant 20 unités par millilitre d’IL, deux incubés à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Effectuez une coloration d’anticorps tricolore pour les nouvelles cellules tumorales positives, suivie d’une immunoglobuline anti-US PE et d’un iodure de propidium Xin five et d’un iodure de propidium conformément au protocole du fabricant sur les nouvelles cellules tumorales positives et analysez la viabilité des cellules tumorales avec un Xin five pi. L’activation des lymphocytes T avec BI pendant 16 heures entraîne la mort des lymphocytes T naïfs qui ne sont pas sensibilisés à la tumeur in vivo.

Après la bi-sélectivité des lymphocytes T réactifs à la tumeur, ils se développent jusqu’à 2,8 fois au cours d’une culture de six jours avec les cytokines de la chaîne gamma, les lymphocytes T CD huit positifs et CD quatre positifs sont également élargis avec les cytokines de la chaîne gamma. Après une culture ex vivo de six jours, les lymphocytes T expansés ex vivo présentent une réactivité élevée contre les tumeurs auxquelles les souris donneuses ont été sensibilisées, comme l’a évalué la production d’interféron gamma. En présence de nouvelles cellules tumorales positives pour le carcinome mammaire de souris ou MMC, les cellules T expansées ex vivo peuvent induire l’apoptose dans les nouvelles cellules tumorales MMC positives, de sorte que la viabilité des cellules tumorales passe de 92 % à 61 % en 48 heures.

Lorsque vous essayez cette procédure, vous devez vous rappeler de travailler dans des conditions aseptiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sélectionner et d’étendre les lymphocytes T actifs de la tumeur pour la thérapie adaptative des cellules T des cancers.