Name: Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Apprenez une technique histologique pour préparer des coupes paraffinées et congelées des muscles thoraciques de Drosophila. Cette méthode permet d'analyser la morphologie musculaire et la localisation des protéines avec précision.

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Nous remercions le Professeur Eichele de nous avoir permis d&#39;utiliser la cryo-microtome. Le travail a été financé par Max-Planck-Gesselschaft.

1. Préparation <ol><li> Fraîchement préparer fixateur de Carnoy, en combinant l'éthanol absolu, le chloroforme et l'acide acétique glacial en proportion 06:03:01 respectivement. 3 Ceci, ainsi que toutes les solutions pour cols submergeant devraient être conservés dans des bocaux en verre coloration (voir la section des réactifs pour la recommandation). </li><li> Préparer une feuille d'aluminium poches de la taille correcte pour les colliers. </li><li> Préparer les solutions suivantes dans la coloration des pots: 2 X 40% d'éthanol, 70% d'éthanol, l'éthanol 2 X 100%, méthylbenzoate (Mo), 50/50 v / v Mo et la paraffine, la paraffine X 2. Placez le MB et les conteneurs de paraffine dans un incubateur réglé à 60-65 ° C. </li><li> Paraffine chaude pour verser dans les poches aluminium à 60-65 ° C. </li></ol> 2. Fixation mouches dans Colliers <ol><li> Fixez le collier 4 sous la loupe binoculaire à l'aide de bandes en position verticale où vous pouvez voir le point d'entrée pour le voler. </li><li> Anesthetize mouches avec du dioxyde de carbone ou via l'hypothermie en utilisant un bloc de glace. Soyez prudent de ne pas geler les mouches. </li><li> En utilisant des pinces, ramasser des mouches individuels en saisissant leurs ailes et les placer dans le col correctement orienté (tête et thorax au-dessus des lames et l'abdomen, sous les lames). 10-20 mouches devraient facilement dans le col. </li></ol> Remarque: Si vous analysez plusieurs génotypes, n'oubliez pas de faire une note du numéro de collier et le génotype correspondant. 3. Coupes de paraffine de thorax drosophile <ol><li> Relocaliser le col à la solution du Carnoy et fixer le tissu à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Après fixation, déshydrater l'échantillon en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol. Pour 10 minutes chacune plonger le col dans 40% (2 fois), 70% et 100% (2 fois) d'éthanol à température ambiante. Suivant cols incuber dans une solution de Mo et Mo de paraffine + (1:1) pendant 30 min dans chaque puis infiltrer le col en deux changements de paraffine pour 60 min chacun à 60-65 ° C. Rapidement déplacer le collier dans la poche d'aluminium et remplir de fondu (60-65 ° C) de paraffine. Placez-le à température ambiante et permettre à la paraffine pour devenir dur (il est préférable de laisser toute la nuit). Notez que le collier peut être placé dans la poche une feuille dans différentes orientations, en fonction de l'orientation des sections dont vous avez besoin (longitudinale ou transversale). </li><li> Déballer les blocs de paraffine sèche avec des colliers de la feuille et délicatement séparer le collier de son bloc de paraffine. Avec l'aide d'une lame tranchante ou d'un scalpel découpez soigneusement la paraffine extra-partir autour du tissu volée. </li><li> Couper le bloc de paraffine à 7-10 étapes section pm sur un microtome de rotation et de permettre le tissu coupé pour flotter à plat dans un bain à 37 ° C l'eau. Placer le tissu sectionnée sur les lames polaires et laisser sécher pendant la nuit. Ces diapositives peuvent être utilisées pour la coloration avec hématoxyline et l'éosine (figure 1A-D), le bleu de toluidine, le bleu d'aniline ou décède d'autres de visualiser les structures des tissus, ainsi que pour la coloration des anticorps (figure 1E-E ``). </li></ol> 4. Cryocoupes du thorax chez la drosophile <ol><li> Comme avec des sections de paraffine, de préparer les mouches dans un collier et de la mode d'une poche d'aluminium. Un refroidisseur de gel seront nécessaires pour préparer les échantillons. Assurez-vous que le refroidisseur est autour de -60 ° C, utilisez un peu d'éthanol et de glace sèche pour permettre d'atteindre cette température. Une heure avant de commencer l'expérience mettre la bouteille de milieu cryo-intégration (Tissue-Tek octobre composés) à l'envers dans un réfrigérateur à 4 ° C afin de le refroidir et de minimiser la formation de bulles d'air. </li><li> Relocaliser le col avec des mouches à la poche une feuille qui a été pré-refroidi pendant plusieurs minutes à l'intérieur du refroidisseur de congélation et de combler rapidement avec le composé cryo-enrobage. Laissez le gel de l'échantillon pendant 3-10 min. Soigneusement déballer le bloc formé à l'intérieur du refroidisseur, délicatement séparés le col du bloc de l'incorporation et le mettre à -20 ° C pendant au moins un jour. </li><li> Coupez les muscles gelés sur un cryo-microtome entre -15 et -18 ° C avec une épaisseur de coupe de 10-15 um. Placer sur des lames polarisée et la garder au -20 ° C jusqu'au moment de faire un traitement ultérieur. Nous vous suggérons de fixer les tissus dans le formol solution à 4% du PBS pendant 10 min à température ambiante avant la coloration des anticorps. </li></ol> 5. Détection des lipides dans les muscles chez la drosophile Gouttelettes lipidiques peuvent être détectés avec de l'huile rouge O tache sur cryocoupes utilisant un protocole adopté par Sieber et Thummel 5. <ol><li> Après fixation, laver les lames avec de l'eau deux fois pendant 5 min, équilibrée dans du propylène glycol pendant 10 min et laisser incuber pendant 3 h dans de l'huile rouge O tache à température ambiante. Puis laver les échantillons 2 fois pendant 5 min dans du propylène glycol et 30 min dans du PBS. Mont de glycérol 30%. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> FigUre 1. Paraffine-incorporés sections Hématoxyline éosine et colorées transversale (AB) et longitudinale (CD) des sections de muscles de vol indirect. A et C montre normale muscles structurés. Anormale par les muscles taille et la morphologie sont représentés sur B et D, respectivement (flèches noires). Coupe transversale de thorax tachés drosophile avec des anti-LAMC, marqueur de l'enveloppe nucléaire et le DAPI, colorant nucléaire (EF). Vue agrandie de la normale (flèche rouge) et se sont détériorées (flèche jaune) des muscles (F). G représente la section du vitrail drosophile intestinal avec LAMC et DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Des sections congelées A. Les sections transversales congelés de vitraux du thorax chez la drosophile à l'huile rouge O, lipides gouttelettes étiquette. B. longitudinale des coupes congelées de muscles vol indirect teinté d'anti-Dg, le muscle sarcolemme marqueur et DAPI.

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).</li>
<li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li>
<li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li>
<li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnoy+fixation%3A+practical+and+theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemie%22%5BJournal%5D)">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila+-+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila - A Laboratory Manual</a>. , CSHL Press. (1989).</li>
<li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Colliers en acier inoxydable</td><td>Confectionnés maison</td><td></td><td>Spécialement conçus</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d'aluminium</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame ou scalpel</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac de coloration macro Wheaton</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Modèle : Hyrax M25</td></tr><tr><td>Cryo-microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Modèle CM3050S</td></tr><tr><td>Incubateur à 60-65&amp;#x00B0;C</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Assez grand pour contenir au moins 4 bacs de coloration</td></tr><tr><td>Congélateur avec bloc métallique</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>À conserver à -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lames Super-frost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>9161155</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td>Recommandé : 24 x 40 mm</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100063</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100983</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Méthylbenzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M29908-500G</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76258</td><td>Paraffine</td></tr><tr><td>Composé Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde à 16 %, sans méthanol</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

les articles inclus en paraffine et congelés de drosophile</emmuscles adultes>

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

La caractérisation moléculaire des dystrophies musculaires et myopathies chez les humains a révélé la complexité de la maladie du muscle et de l&#39;analyse génétique de la spécification musculaire, la formation et de fonctionner dans des systèmes modèles a fourni des informations précieuses sur la physiologie musculaire. Par conséquent, identifier et caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les dommages musculaires est essentiel. La structure de l&#39;adulte de drosophile multi-fibres musculaires ressemblent vertébrés muscles striés 1 et la traçabilité génétique de la drosophile a fait un excellent système pour analyser la morphologie des muscles dystrophiques et de caractériser les processus qui affectent la fonction musculaire chez les adultes du vieillissement des mouches 2. Ici, nous présentons la technique histologique pour la préparation de paraffine et congelés des sections de muscles thoraciques chez la drosophile. Ces préparations permettent de tissus à teindre avec des colorants histologiques classiques et étiquetés avec des colorants protéines détecter, et plus précisément cryocoupes sont idéales pour la détection immunohistochimique des protéines dans les muscles intacts. Cela permet l&#39;analyse de la structure des tissus musculaires, l&#39;identification des défauts morphologiques, et la détection du patron d&#39;expression pour le muscle / neurone-spécifique des protéines dans les muscles pour adultes drosophile. Ces techniques peuvent aussi être légèrement modifiée pour la coupe d&#39;autres parties du corps.

L&#39;identification des mécanismes sous-jacents des lésions musculaires est cruciale. Ici, nous présentons la technique histologique pour la préparation de paraffine et congelés des sections de muscles thoraciques chez la drosophile. Cela permet l&#39;analyse de la morphologie des muscles et la localisation des protéines et autres composants de la cellule musculaire.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

La caractérisation moléculaire des dystrophies musculaires et des myopathies chez l'humain a révélé la complexité des maladies musculaires, et l'analyse génétique de...

La technique histologique suivante permettant la préparation de coupes incluses en paraffine et de coupes congelées des muscles thoraciques de drosophile offre une méthode puissante pour analyser la morphologie musculaire et l'expression protéique. Cette méthode consiste d'abord à immobiliser les animaux dans des colliers, puis à inclure le tissu, en paraffine ou dans un milieu OCT. Les thorax inclus sont ensuite coupés au microtome.Enfin, les coupes sont colorées afin de visualiser les structures des tissus musculaires ou de détecter différents composants moléculaires des muscles. Les échantillons obtenus, lorsqu'ils sont utilisés en combinaison avec des méthodes classiques de coloration histologique, des colorants fluorescents ou une immunocoloration, peuvent révéler la morphologie du tissu musculaire ainsi que la localisation de composants spécifiques au muscle. Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité à récupérer de minces lames musculaires dans une configuration correspondant à leur disposition naturelle au sein de l'animal.Cette méthode peut facilement être adaptée à d'autres systèmes, comme l'abdomen de la tête de Drosophila. Elle a été mise au point dans le laboratoire de Helena Sheta, laboratoire d'expression génique et de signalisation, et sera démontrée aujourd'hui par Maria Rinko. Conservez toutes les solutions destinées à immerger les colliers dans des bocaux en verre pour coloration dès le départ.Préparez un fixateur Carnoy frais en mélangeant de l'éthanol absolu, du chloroforme et de l'acide acétique glacial dans les proportions respectives de six, trois et un. Confectionnez un empilement de feuilles d'aluminium, découpées à la bonne taille pour les colliers. Préparez également les solutions d'éthanol, de méthanol et de paraffine dans des bocaux de coloration.Maintenant, placez les récipients contenant le benzoate de méthyle et la paraffine dans un incubateur réglé à 60 à 65 degrés Celsius. En outre, chauffez davantage de paraffine à 60 à 65 degrés Celsius. Pour verser dans les poches en aluminium, fixez le collier sous le microscope à l’aide de ruban adhésif en position verticale afin que le point d’entrée de la mouche soit visible.Anesth&eacute;siez les mouches soit en utilisant du dioxyde de carbone, soit par hypothermie &agrave; l'aide d'un bloc de glace. Prenez garde &agrave; ne pas congeler les mouches en utilisant des pinces. Saisissez chaque mouche individuellement par les ailes et placez-la dans le collier de mani&egrave;re &agrave; ce que sa t&ecirc;te et son thorax se trouvent au-dessus des lames et que son abdomen soit situ&eacute; en dessous des lames.Placer de 10 à 20 mouches dans chaque collier lors de l'analyse de plusieurs génotypes. Noter le numéro du collier et le génotype correspondant. Transférer le collier dans la solution de Carnoy et fixer le tissu à quatre degrés Celsius toute la nuit.Après la fixation, déshydratez l'échantillon en immergeant le collet dans des bains d'éthanol de concentrations croissantes pendant 10 minutes chacun à température ambiante. Ensuite, incubez le collet dans du benzoate de méthyle, puis dans une solution de benzoate de méthyle additionnée de paraffine pendant 30 minutes chacun, puis imbibez le collet de paraffine en deux changements successifs pendant 60 minutes chacun. Entre 60 et 65 degrés Celsius, transférez rapidement le collet dans une pochette en aluminium.À ce stade, le collier doit être positionné dans les pochettes en aluminium afin de faciliter l'orientation des sections, longitudinale ou transversale. Ensuite, remplir les pochettes avec du paraffine fondue afin de permettre la solidification de la paraffine. Laisser les pochettes en aluminium à température ambiante toute la nuit.Déballez délicatement les blocs de paraffine sèche munis de collerettes en les retirant de la feuille d'aluminium, puis séparez soigneusement la collerette du bloc de paraffine à l’aide d’un scalpel tranchant. Taillez avec précaution l’excédent de paraffine autour du tissu de drosophile sur un microtome rotatif. Découpez le bloc de paraffine en sections de sept à dix micromètres d’épaisseur.Laisser le tissu découpé flotter à plat dans un bain d'eau à 30 degrés Celsius. Enfin, placer le tissu sectionné sur des lames polaires et sécher toute la nuit. Ces lames sont désormais prêtes à être colorées avec de l'hématine et de l'éosine.Une heure avant de commencer l'expérience, placer la bouteille de milieu d'inclusion cryogénique à l'envers dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius afin de la refroidir et de minimiser la formation de bulles d'air. En outre, préparer un congélateur à moins 60 degrés Celsius à l'aide d'éthanol et de glace sèche. Comme pour les sections au paraffin, immobiliser les mouches dans un collier, transférer le collier contenant les mouches vers une pochette en aluminium prérefroidie, puis remplir rapidement avec le composé d'inclusion cryogénique OCT.Laisser durcir le OCT. Déballer soigneusement le bloc formé à l'intérieur du réfrigérateur. Séparer délicatement le manchon du bloc d'encapsulation et le placer à moins 20 degrés Celsius pendant au moins un jour. Sur un microtome cryogénique, couper les muscles congelés entre moins 15 et moins 18 degrés Celsius avec une épaisseur de section de 10 à 15 micromètres.Ensuite, placer les échantillons sur des lames polarisées. Conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour un traitement ultérieur. Les pertes lipidiques peuvent être détectées avec une coloration au rouge d'huile O sur des coupes cryogéniques.En utilisant un protocole adapté de Seber et Tum, gardez à l'esprit que, immédiatement avant la coloration, les coupes congelées doivent être fixées dans du formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes après la fixation. Rincez les lames deux fois à l'eau, cinq minutes chacune. Ensuite, équilibrez dans le propylène glycol pendant 10 minutes.Incuber maintenant pendant trois heures dans l'huile. Colorer en rouge oléine à température ambiante. Laver ensuite les échantillons deux fois pendant cinq minutes dans du propylène glycol, suivis de 30 minutes dans du PBS. Monter les échantillons dans de la glycérine à 30 %, puis colorer à l'hématine et à l'éosine. Les sections transversales et longitudinales des muscles indirects du vol permettent de différencier la taille et la morphologie anormales des muscles de structure normale.Des coupes incluses dans la paraffine peuvent également être efficacement marquées par des anticorps, comme indiqué dans cette section du tube digestif de drosophile, illustrant le marqueur de l'enveloppe nucléaire. Lamin C et la coloration nucléaire dpi. Ici, des sections transversales du thorax de drosophile sont marquées par l'anticorps anti-lamin C et par le dpi afin de montrer une vue agrandie de muscles normaux et détériorés.De même, des coupes longitudinales congelées de muscles indirects du vol peuvent être marquées avec l'anticorps anti-dystrophine, le glycan musculaire, le marqueur de sarcolemme et le DPI, tandis que des coupes transversales congelées de thorax de drosophile marquées à l'huile rouge O révèlent les gouttelettes lipidiques. La combinaison de ces techniques avec d'autres méthodes, telles que la coloration au HNE et la détection immunohistochimique, constitue une approche puissante pour déterminer la structure tissulaire et la localisation des protéines dans les muscles.

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drosophile Dissection musculaire de vol indirect (IFM) de la chrysalide tardive : une méthode de prélèvement de tissus à haut débit

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Évaluation de l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales chez la drosophile

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