Name: Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des cellules souches épithéliales adultes de peau humaine par digestion enzymatique et microdissection. Cette technique permet d'étudier la régénération cutanée et la médecine régénérative.

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1. Extraire des cellules souches épithéliales de la peau humaine <ol><li> Avant de commencer la procédure d'isoler des cellules souches épithéliales on a besoin pour préparer les médias respectifs et des réactifs (voir tableau 1). </li><li> Fraîches peau du cuir chevelu humain adulte à partir de procédures lifting ou biopsie est recueilli, puis incuber dans FBS DMEM / 10% / dispase (4 mg / mL) pendant la nuit à 4 ° C. L'incubation pendant 2-4 heures à 37 ° C est également efficace. Morceaux de peau doit être d'une largeur maximale de 1 cm pour permettre l'enzyme de pénétrer. </li><li> Transfert de la peau dans une boîte de Pétri stérilisées, arracher chaque poil de la peau en saisissant la tige du cheveu près de la surface de la peau et en tirant fermement et en douceur. Sélectionnez follicules au stade télogène basée sur leur morphologie sous un microscope à dissection, découpez la région renflement (figure 1A) follicules transférer dans un tube de 15 ml stérilisés. Follicules anagène peut aussi être utilisée si elle est coupée à la partie supérieure 1 / 3 du follicule pour obtenir follicule pileux "renflement" région (figure 1B). </li><li> Incuber les fragments isolés du follicule dans un mélange de 0,05% de trypsine-EDTA (Gibco) et Versène (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (01h01) pour 15-20 min à température ambiante avec agitation périodique, ajouter 4 ml de DMEM + 10 % de FBS pour arrêter la réaction, ralentit pendant 5 min à 800 rpm. Alternativement, des explants de tissu folliculaire fragment peut être mis en culture, sans trypsine digérer pour des cellules en culture à partir de follicules simples. </li><li> Rejeter le surnageant avec soin (~ 0,2 à 0,5 ml sauver pour éviter de perdre des cellules) et remettre en suspension dans 1 ml de KCM (moyenne des kératinocytes), sans EGF. </li></ol> 2. Culture primaire des cellules souches épithéliales <ol><li> Avant de cultiver les cellules souches épithéliales, la mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules (cellules nourricières) doit être préparé comme suit. 3T3-J2 cellules sont cultivées dans du DMEM avec 10% de FBS avant le traitement. Retirez le support de culture cellulaire et laver deux fois avec PBS, traiter cellule avec 15μg / ml de mitomycine C dans du DMEM sans sérum pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Retirez la mitomycine C contenant du DMEM et laver deux fois avec du PBS, les cellules sont prêtes à utiliser. (Mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules peuvent également être préparés précédemment et stocké à -80 ° C. Dégel et les graines des cellules un jour avant culture primaire des cellules souches épithéliales, incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. 150,000-200,000 3T3-J2 cellules par puits de plaque de 6 puits est recommandée. </li><li> Graine cellule isolée tige follicule pileux de l'étape 1.5 sur mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules dans KCM, sans la nuit à 37 ° C EGF, 5% de CO 2, a changé d'EGF-KCM contenant le lendemain. Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO 2. Tous les kératinocytes sont nourris avec KCM contenant EGF tous les 2 jours et cultivés pendant 14-20 jours. Vérifiez la cellule chaque jour sous le microscope. Cellules souches du follicule pileux va former des colonies (figure 2A). Explants follicule pileux se forme des excroissances après 10-14 jours (figure 2B). </li></ol> 3. Cellules souches épithéliales Passage <ol><li> Laver les cellules avec du PBS fois. Retirer des cellules nourricières 3T3-J2 par Versène (pré-chauffé à température ambiante) de traitement. Incuber la culture bombé en Versène pendant 5 minutes, puis secouez doucement et aspirer hors des cellules nourricières. </li><li> Laver les cellules souches du follicule pileux soit avec ou PBS Versène une seule fois. </li><li> Ajouter préchauffé (à 37 ° C, critique) trypsine-EDTA (2X) et incuber à 37 ° C pendant 7 minutes ou plus si nécessaire pour les cellules souches du follicule pileux se détacher. Pas plus de 15 minutes est la meilleure. </li><li> Ajouter KCM w / o FEM pour arrêter la trypsine, délicatement la pipette de haut en bas pour disperser les cellules, ralentit au 200g, à 5 minutes. </li><li> Re-suspendre les cellules avec KCM sans EGF, le comte et re-plaque sur la mitomycine C-traitée 3T3-J2 couche de cellules. </li></ol> 4. Immortalisez cellules souches épithéliales Les cellules primaires, cellules souches, même adulte, atteint la sénescence, après passage en série et des mois dans la culture. L'immortalisation des cellules souches primaires est un moyen efficace pour soulager ce problème. <ol><li> Plaque primaires cellules souches épithéliales (~ 350 000 cellules / puits de plaque de 6 également) au passage 1 sur couche nourricière (3T3-J2) et la culture pendant 2 jours. </li><li> Culture PA317 LXSN lignée cellulaire 16E6E7 un jour après l'ensemencement des cellules souches épithéliales primaires avec du DMEM contenant 10% de FBS. (Cette ligne produit le LXSN16E6E7 rétrovirus amphotropes qui encode la E6 et E7 du HPV16 cadres ouverts de lecture, et qui peut être utilisé pour infecter de façon stable et immortaliser de nombreux types cellulaires). </li><li> Traiter PA317 ligne LXSN cellules 16E6E7 à la mitomycine C pendant 2 heures (même protocole avec 3T3-J2 cellules). Ajouter la mitomycine C traités PA317 ligne LXSN cellules 16E6E7 aux cellules souches épithéliales primaires, co-culture pendant 6 jours dans KCM avec EGF. Renouveler KCM frais avec EGF médias tous les 2 jours. </li><li> Retirer 3T3-J2 et PA317 LXSN 16E6E7 cellule avec Versène. Ajouter la mitomycine C cellules traitées PSN 3T3-J2 (néomycine, hygromycine, puromycine résistants, ~ 200 000 cellules par puits) pour les cellules souches épithéliales. Les cellules sont sélectionnés sous 0,2 mg / ml de G418 (Gibco) pour ajouteritional 6 jours. Renouveler frais KCM G418 contenant l'EGF médias tous les 2 jours. Survivre cellules souches épithéliales sera immortalisé les cellules souches. Un puits de cellules souches épithéliales primaires qui ne sont pas co-cultivées avec des cellules PA317 LXSN 16E6E7 doit être défini comme un contrôle pour la sélection au G418, toutes les cellules dans ce puits devrait être tué par G418 après 6 jours de sélection. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Passage précoce des cellules souches épithéliales et la peau immortalisé cellules souches épithéliales forment des colonies serrées constituée de kératinocytes de petite taille (figure 2A) entouré de cellules nourricières. Si cultivées en milieux exempts de sérum avec des suppléments défini, sans une couche nourricière, les cellules souches se dispersent et ne pas former des colonies serrés (ils poussent comme des cellules individuelles et de petits amas). Immortalisé cellules souches épithéliales maintenir un phénotype stable pendant&gt; 12 mois de passage en continu, mais avaient tendance à former des colonies plus serré que les cellules primaires. Ils ne forment pas des colonies indépendantes d'ancrage dans les dosages agar mou, indiquant que ces cellules immortalisées ne possèdent pas les caractéristiques des cellules cancéreuses. Les deux primaires et immortalisées de cellules souches épithéliales expresse follicule pileux marqueur de cellules souches cytokératine 15 (figure 3A), et sont capables de se différencier en follicule pileux épidermique, et les lignages sébacées (figure 3B-D). <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Pincées poils. Après la cueillette de dispase peau traitée, les follicules pileux apparaissent comme étant soit des poils du club télogène (A) avec une boule de cellules entourant le bas de la chevelure, ou les poils anagène (B) avec un manchon d'épithélium entourant la longueur des cheveux. La région de renflement télogène formes morphologiques distinctes d'une région à la micro-dissection, tandis que le renflement anagène est moins distincte. L'ampoule contient anagène kératinocytes matrice, représentant de transit d'amplification des cellules qui peuvent également être isolées et cultivées. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les cellules souches cultures. (A) des cellules souches épithéliales de la peau sous forme serrée colonies épithéliales (désigné par E) lorsqu'elles sont cultivées dans KCM avec une couche nourricière de cellules (désigné par F). (B) explants follicule pileux donnent lieu à des excroissances épithéliales. La région de renflement télogène (désigné par T) est attaché au plat et entouré colonie de cellules épithéliales avec des cellules nourricières. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Différenciation des cellules souches. (A) Les cellules souches colonies maintenir l'expression des marqueurs épithéliaux tels que la cytokératine 15. (B) des cellules souches épithéliales cutanées peuvent être différenciées selon la lignée follicule pileux tel que déterminé par l'expression K6Hf. (C) Les cellules peuvent être cultivées sur de-epidermalized derme ou d'autres matrices à l'interface air-liquide et sous forme d'un épiderme stratifié avec couche cornée, couche granuleuse et la couche épineuse. (D) Les cellules souches peuvent être induits le long de la lignée sébacées avec l'huile rouge des globules positif.

<ol><li>Jones, P. H., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+stem+cells+from+transit+amplifying+cells+on+the+basis+of+differences+in+integrin+function+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression.</a> Cell. 73, 713-724 (1993).</li>
<li>Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C8%2F144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).</li>
<li>Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+the+intestinal+stem+cell+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm.</a> Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).</li>
<li>Slac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in epithelial tissues.</a> Science. 287, 1431-1433 (2000).</li>
<li>It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-134 (2005).</li>
<li>Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+find+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells find their niche.</a> Nature. 414, 98-104 (2001).</li>
<li>Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+follicular+stem+cells+in+forming+not+only+the+follicle+but+also+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis.</a> Cell. 102, 451-461 (2000).</li>
<li>Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+renewal+of+hair+follicles+from+adult+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells.</a> Cell. 104, 233-245 (2001).</li>
<li>Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotsarelis+G+Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li>
<li>Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell.+%26+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).</li>
<li>Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((delivery+to+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">delivery to the hair follicle.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 8, 204-206 (2003).</li>
<li>Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+stem+cell-targeted+gene+transfer+and+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system.</a> Gene Ther. 13, 732-737 (2006).</li>
<li>Stenn, K. S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+hair+follicle%3A+fringe+benefits+of+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).</li>
<li>Hoeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+rapid+method+to+construct+skin+equivalents+from+human+hair+follicles+and+fibroblasts.+Exp+Dermatol+10%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10.</a> , 264-271 (2001).</li>
<li>Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reepithelialization+of+a+full-thickness+burn+from+stem+cells+of+hair+follicles+micrografted+into+a+tissue-engineered+dermal+template+%28Integra%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra).</a> Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).</li>
<li>Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hair+growth+deficiency+is+linked+to+a+genetic+defect+in+the+phospholipase+gene+LIPH%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH.</a> Science. 314, 982-985 (2006).</li>
<li>Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+epidermolysis+bullosa+by+transfer+of+wild-type+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells.</a> Blood. 113, 1167-1174 (2009).</li>
<li>Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+transplantation+for+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).</li>
<li>Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Correction+of+Type+VII+Collagen+Expression+in+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa.</a> J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li>
<li>Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+graying%3A+incomplete+melanocyte+stem+cell+maintenance+in+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.</a> Science. 307, 720-724 (2005).</li>
</ol>

Les méthodes d&#39;extraction de cellule et la culture sont étonnamment faciles décrit et reproductible. Nous avons généré cultures de cellules souches épithéliales de plusieurs dizaines de personnes à travers une large tranche d&#39;âge, y compris les patients avec des défauts de la peau a hérité de 18 ans. Il est préférable de commencer le processus le jour de la récolte des tissus, mais les cellules restent viables dans les médias sur la glace pendant plusieurs jours, ce qui facilite expédition durant la n...

Les médias des kératinocytes (KCM) [DMEM et Ham s F12 (Gibco, 3:1), l&#39;adénine (Sigma, 180 mm), 10% sérum de veau fœtal (Gibco), la toxine cholérique (CII, 0,1 nM), pénicilline / streptomycine (GIBCO, 100 U / ml et 100 mg / ml, respectivement), de l&#39;hydrocortisone (Sigma, 0,4 mg / ml, 1,1 mM), T/T3 (transferrine, GIBCO, 5 pg / ml, 649 nM, et triiodo-L-thyronine, Sigma, 2 nM) , l&#39;insuline (Sigma, 5 mg / ml, 862 nM), et l&#39;EGF (Sigma, 10 ng / ml, 1,6 nM), pH 7,2]

isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

L&#39;homéostasie de tous les tissus d&#39;auto-renouvellement est dépendant sur les cellules souches adultes. Comme les cellules souches indifférenciées subissent des divisions asymétriques, elles génèrent des cellules filles qui gardent le phénotype de cellules souches et de transit d&#39;amplification des cellules (cellules TA) qui migrent de la niche de cellules souches, subissent la prolifération rapide et en phase terminale se différencier pour repeupler le tissu. Les cellules souches épithéliales ont été identifiés dans l&#39;épiderme, du follicule pileux, et de l&#39;intestin que les cellules avec un haut potentiel prolifératif in vitro et en tant que lente vélo étiquette de rétention des cellules in vivo 1-3. Adulte, tissu-spécifique des cellules souches sont responsables de la régénération des tissus dans lesquels ils résident pendant le changement physiologique normale, ainsi que pendant les périodes de stress 4-5. Par ailleurs, les cellules souches sont généralement considérés comme étant multi-puissant, possédant la capacité de donner naissance à plusieurs types de cellules dans le tissu 6. Par exemple, les cellules de rongeurs souches du follicule pileux peut générer l&#39;épiderme, les glandes sébacées et les follicules pileux 7-9. Nous avons montré que les cellules souches provenant de la région bulbe du follicule pileux humain présentent multi-potentialité 10. Les cellules souches sont devenues un outil précieux dans la recherche biomédicale, en raison de leur utilité comme un système in vitro pour étudier la biologie du développement, la différenciation, la tumorigenèse et de leur utilité thérapeutique possible. Il est probable que les cellules souches adultes épithéliales sera utile dans le traitement de maladies telles que dysplasies ectodermiques, monilethrix, Netherton syndrome, la maladie de Menkes, l&#39;épidermolyse bulleuse héréditaire et alopécies 11-13. En outre, les autres problèmes de peau tels que des brûlures, des plaies chroniques et des ulcères bénéficieront de thérapies aux cellules souches 14,15. Etant donné le potentiel de reprogrammation de cellules adultes dans un état ​​pluripotentes (cellules iPS) 16,17, les cellules facilement accessibles et extensible souches adultes dans la peau humaine peut fournir une source précieuse de cellules pour l&#39;induction et le traitement en aval pour un large éventail de maladies, y compris le diabète et la maladie de Parkinson.

Une façon rapide, robuste d&#39;isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l&#39;isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

L'homéostasie de tous les tissus capables d'auto-renouvellement dépend des cellules souches adultes. À mesure que les cellules souches indifférenciées subissent des divisions asymétriques, elles génèrent...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de cultiver des cellules souches épithéliales adultes à partir de peau humaine. Cela est réalisé en découpant d'abord la peau humaine fraîche provenant d'une lifte, ou d'une autre intervention chirurgicale, en bandes d'un centimètre de large, puis en les incubant dans un milieu contenant de l'espace discale. La peau est ensuite rincée dans un milieu frais et les follicules pileux sont arrachés.Ensuite, les follicules sont séparés en follicules télogènes et en follicules antigéniques en les examinant au microscope stéréoscopique ; la dernière étape du protocole consiste à traiter les follicules à la trypsine afin d'obtenir une suspension monocellulaire et à les ensemencer dans des boîtes de culture. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une croissance cellulaire clonogénique par contraste de phase. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de découpage, d'arrachage et d'identification sont difficiles à apprendre, peu de personnes étant familières avec la dissection assistée par microscope des tissus cutanés et des follicules pileux.Pour commencer l'extraction de cellules souches

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Cet article présente un protocole robuste pour l'isolement et la culture des cellules souches neurales de crête des follicules pileux humains.

Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Cette vidéo décrit l'isolement des kératinocytes, les cellules les plus proéminentes de la couche épidermique de la peau humaine, en utilisant une combinaison de méthodes de digestion enzymatique et de perturbation mécanique. Cette méthode aide à la croissance préférentielle des kératinocytes par rapport aux autres types de cellules cutanées à l’aide d’un milieu de croissance sélectif.

Isolement des kératinocytes de la peau humaine : une méthode de culture des kératinocytes primaires à partir d’échantillons de peau

Nous rapportons une méthode pour isoler les cellules naïves multipotentes précurseurs dérivés de la peau (SKP) à partir de cultures de fibroblastes humains primaires. Nous montrons que ces SKPs issus de cultures de fibroblastes partagent des propriétés semblables des cellules souches à celles provenant directement de biopsies de peau humaine. Ces cellules expriment le marqueur de la crête neurale, nestine, en plus des marqueurs tels que OCT4 multipotentes et Nanog.

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

Les kératinocytes épidermiques forment une barrière fonctionnelle de la peau et sont positionnés à la ligne de front de la défense de l'hôte contre les insultes environnementales externes. Nous décrivons ici des méthodes d'isolement et de culture primaire de kératinocytes épidermiques provenant de peau de souris néonatale et adulte, et l'induction de la différenciation terminale et la réponse inflammatoire déclenchée par les UVB des kératinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de kératinocytes oraux dérivés du palais de souris adulte. Une méthode d’évaluation utilisant l’immunocoloration est également rapportée.

Isolement et culture de kératinocytes oraux primaires du palais de souris adulte

L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.

Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Apprenez à isoler et cultiver des cellules souches épithéliales adultes de peau humaine par digestion enzymatique et microdissection. Cette technique permet d'étudier la régénération cutanée et la médecine régénérative.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

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