Induction de l’autophagie basée sur l’ADI dans les cellules cancéreuses de la prostate : une technique enzymatique pour mesurer la réponse autophagique dans les cellules

L’autophagie est un processus intracellulaire qui facilite la dégradation des composants cytoplasmiques indésirables et des organites dans des compartiments digestifs spécialisés appelés lysosomes. Pour évaluer l’autophagie, il faut commencer par une culture adhérente de cellules cancéreuses de la prostate exprimant des protéines marqueurs autophagiques appelées LC3 couplées à des protéines fluorescentes vertes.

De manière inhérente, les cellules cancéreuses de la prostate sont dépourvues de l’enzyme argininosuccinate synthase nécessaire à la synthèse des acides aminés de l’arginine. Ces cellules dépendent donc de la supplémentation externe en arginine par le biais de milieux pour leur survie et leur prolifération.

Ensuite, traitez les cellules avec de l’arginine déiminase ou de l’ADI. L’ADI hydrolyse l’arginine libre dans le milieu, entraînant une appauvrissement en arginine. En conséquence, les cellules subissent un stress métabolique, initiant une réponse autophagique interne. Simultanément, traitez les cellules avec un colorant fluorescent rouge qui marque les lysosomes à l’intérieur des cellules.

Au cours de l’autophagie, des structures membraneuses en forme de coupe appelées phagophores s’assemblent autour des composants cytoplasmiques endommagés. Finalement, ils se dilatent et scellent leur cargaison tout en se conjuguant avec les protéines marqueurs autophagiques LC3 pour former des vésicules à double membrane ou autophagosomes. Les protéines LC3 fournissent également des marqueurs fluorescents aux autophagosomes. Les vésicules fusionnent ensuite avec les lysosomes pour former des autolysosomes. Les protéases lysosomales contenues dans les autolysosomes dégradent les composants cellulaires engloutis.

En temps réel, observez la fluorescence brillante des autophagosomes et des lysosomes pour déterminer leur distribution au sein des cellules.

Pour commencer, cultivez des cellules cancéreuses de la prostate humaines exprimant la chaîne lumineuse 3 couplée à des protéines fluorescentes vertes sur des boîtes de culture à fond de verre recouvertes de poly-D-lysine de 35 millimètres, comme décrit dans le protocole de texte.

Les cellules doivent être plaquées à une densité suffisante pour faciliter une prolifération rapide, mais pas au point que les cellules soient envahies par la végétation et agglutinées au moment de l’imagerie. Traitez des échantillons cellulaires sélectionnés avec de l’arginine désaminase, ou ADI, dans le PBS pour épuiser les cellules en arginine libre et induire un stress métabolique dans les cellules cancéreuses.

Environ une heure avant l’imagerie, diluez 1,5 microlitre de LysoTracker Red avec 20 millilitres de RPMI contenant 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Préparez des solutions avec DJA pour les échantillons sélectionnés qui ont été traités.

Après avoir chauffé tous les milieux à 37 degrés Celsius, ajoutez le milieu approprié dans chaque plat de culture. Incuber des cellules avec RPMI contenant LysoTracker Red pendant 15 à 45 minutes à 37 degrés Celsius.

Environ 30 minutes avant l’imagerie, allumez l’enceinte environnementale de la station météo et laissez l’équilibre à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lavez les cellules avec du PBS et remplacez le milieu par un RPMI standard contenant seulement 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques.

Ajouter la DJA aux échantillons comme indiqué. Montez des boîtes de culture à fond en verre de 35 millimètres dans un adaptateur personnalisé. Utilisez de l’huile d’immersion sur l’objectif d’objectif à ouverture numérique de 60X et à ouverture numérique de 1,42 et placez la boîte de culture montée sur la platine du microscope.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.