Dosage de l’influx de calcium pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules cultivées

L’absorption mitochondriale des ions calcium cytosoliques via son complexe uniporteur mitochondrial de la membrane interne est cruciale pour son fonctionnement.

Pour mesurer l’afflux de calcium mitochondrial, commencez par utiliser une plaque multipuits contenant une lamelle recouverte d’ECM au fond de son puits. Plaquez la suspension de fibroblastes sur la lamelle et laissez les cellules adhérer à l’ECM.

Ajoutez un mélange de colorants contenant un colorant inactif, estérifié, rouge-fluorescent, sensible au calcium, et un colorant sélectif des mitochondries-vert-fluorescent. Incuber pour permettre aux molécules de colorant de pénétrer dans le cytosol cellulaire.

Le colorant sensible aux mitochondries se diffuse sélectivement à travers sa membrane et se localise dans la matrice mitochondriale. Le colorant sensible au calcium se répand dans les mitochondries et les espaces extra-mitochondriaux. À l’intérieur de la lumière mitochondriale, les estérases endogènes clivent la fraction ester du colorant rouge, libérant un fluorophore rouge imperméable à la membrane qui reste piégé à l’intérieur des mitochondries.

Ajouter une solution de perméabilisation contenant un tensioactif. À de faibles concentrations, les molécules de tensioactif dissolvent de manière restrictive le cholestérol de la membrane plasmique des cellules, laissant leurs mitochondries intactes et créant des espaces à travers lesquels les molécules de colorant sensibles au calcium s’échappent du cytoplasme. Cela permet de conserver sélectivement les fluorophores rouges sensibles au calcium et les fluorophores verts spécifiques aux mitochondries dans les mitochondries.

Transférez la lamelle dans une chambre d’imagerie fixée sur un microscope confocal et ajoutez un tampon contenant du calcium. À l’intérieur des cellules perméabilisées, localisez les régions présentant une fluorescence rouge et verte colocalisée, indiquant le calcium localisé par les mitochondries. La fluorescence rouge augmente progressivement, représentant une absorption progressive du calcium mitochondrial.

Préparez la solution de travail Rhod-2/AM-MitoTracker Green en mélangeant 20 microlitres de Rhod-2/AM, 0,2 microlitre de MitoTracker Green, 2,5 microlitres de F-127 pluronique à 20 % et un millilitre de solution de Tyrode. Sur une lamelle préalablement préparée et recouverte de cellules NIH 3T3, ajoutez la solution Rhod-2/AM-MitoTracker Green goutte à goutte jusqu’à ce qu’elle soit couverte. Pour que les cellules se chargent avec les colorants, incubez la lamelle, à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à température ambiante.

Pour désestérifier Rhod-2/AM, retirez délicatement la solution Rhod-2/AM-MitoTracker Green et remplacez-la par environ 300 microlitres de solution fraîche de Tyrode pour couvrir les cellules. Incuber la lamelle à l’abri de la lumière, pendant 30 minutes à température ambiante.

Maintenant, transférez la lamelle dans la chambre d’imagerie du microscope et remplissez la chambre avec la solution de lavage. Ajustez la mise au point pour observer les cellules et le contraste de phase à un grossissement de 40x.

Pour perméabiliser la membrane plasmique des cellules Rhod-2/AM-MitoTracker Green-loaded, retirez la solution de lavage de la lamelle et remplacez-la par environ 300 microlitres de solution de perméabilisation pour couvrir les cellules.

Surveiller la morphologie de la membrane plasmique au cours de ce processus. Lorsqu’elles sont perméabilisées, les cellules développent une surface rugueuse. Retirez la solution de perméabilisation immédiatement, après la perméabilisation complète, et remplacez-la par une solution interne de calcium zéro.

Ensuite, concentrez-vous sur les cellules perméabilisées présentant une co-localisation claire de Rhod-2 et MitoTracker Green, afin d’imager simultanément la fluorescence de Rhod-2 et MitoTracker Green.

Ensuite, diminuez les paramètres de laser et de gain du microscope pour rendre la fluorescence mitochondriale Rhod-2 faible et à peine visible.

Pour capturer la cinétique des changements de calcium mitochondrial, sélectionnez « Paramètres du microscope » pour acquérir des balayages bidimensionnels à une fréquence d’images et une durée appropriées. Retirez la solution interne à zéro calcium, en veillant à ne pas perturber les cellules et la mise au point du microscope, puis commencez l’acquisition d’images.

À l’aide d’une seringue, ajoutez manuellement la solution interne remplie de calcium au bout de 10 secondes. Enfin, dans le logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez les régions d’intérêt pour englober les régions de co-localisation du signal Rhod-2 et MitoTracker Green.