Dosage de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN médiés par les PM_2,5 chez les embryons de poissons

Chez le poisson-zèbre, les particules fines ambiantes, ou PM – un polluant atmosphérique – provoquent un dysfonctionnement cardiaque induit par le stress oxydatif.

Pour étudier l’impact des particules sur le poisson-zèbre, il faut commencer par exposer les embryons de poisson-zèbre à de la matière organique extractible dérivée des particules, qui déclenche la génération d’espèces réactives de l’oxygène, ou ROS.

ROS oxyde la guanine, base de l’ADN, en 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine ou 8-OHdG, et provoque la phosphorylation de l’histone H2AX pour former γH2AX - un marqueur des cassures double brin de l’ADN.

Après l’exposition, disséquez le cœur du poisson-zèbre et placez-le sur une lame de verre. Traitez le cœur avec une solution fixatrice qui réticule les protéines, stabilisant ainsi la structure cellulaire.

Ensuite, ajoutez un réactif bloquant pour éviter les sites de liaison non spécifiques. Ajoutez des anticorps primaires qui ciblent γH2AX et 8-OHdG dans les cellules cardiaques.

Ensuite, ajoutez deux anticorps secondaires marqués par fluorescence de couleurs différentes qui se lient spécifiquement à la région Fc de leur anticorps primaire respectif. Enfin, colorez l’échantillon avec du DAPI – un colorant spécifique à l’ADN – qui se lie au sillon mineur des séquences riches en AT dans l’ADN pour former un complexe fluorescent.

Placez la lame sous un microscope à fluorescence pour observer les signaux de l’expression de 8-OHdG et de γH2AX dans le cœur des embryons de poisson-zèbre traités par EOM.

Une intensité de fluorescence significativement élevée des cellules cardiaques indique des dommages oxydatifs à l’ADN induits par l’EOM et des cassures double brin.

Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une lame de verre propre. Ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % à 1,25 microlitre de PBS pour obtenir une solution fixatrice. Ensuite, placez trois cœurs disséqués dans un cercle de barrière hydrophobe et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.

Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins 5 minutes. Lavez les lames trois fois dans PBST, pendant 5 minutes par lavage. Ajoutez 50 microlitres de BSA à 1 000 microlitres de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5 %, et incubez les lames dans une chambre humide pendant 1 heure pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques.

Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 5 minutes par lavage. Diluez deux microlitres d’anticorps monoclonaux de souris contre la 8-hydroxy-désoxyguanosine et deux microlitres d’anticorps polyclonaux de lapin contre gamma-H2AX dans 296 microlitres de PBST, pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.

Incuber les échantillons cardiaques avec 50 microlitres de la solution cocktail d’anticorps primaires, dans une chambre humidifiée pendant au moins 1 heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 degrés Celsius.

Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage. Diluez 1 microlitre d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué FITC et 1 microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre cy3 dans 500 microlitres de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle.

Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité.

Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 5 minutes par lavage. Ajoutez 20 microlitres de DAPI aux échantillons pour la coloration nucléaire, et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Appliquez une lamelle sur la lame et scellez-la avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement et le mouvement.

Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence et quantifiez le signal fluorescent de la zone cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculez les changements relatifs à l’aide de la moyenne des échantillons de contrôle du DMSO et déterminez la signification statistique des données.