Test de ramification du glycogène pour mesurer le degré de ramification du glycogène

Les polysaccharides ramifiés, tels que le glycogène, comprennent des résidus de glucose liés linéairement par des liaisons alpha-1,4-glycosidiques et dans des branches via des liaisons alpha-1,6-glycosidiques.

Pour déterminer le degré de ramification des polysaccharides, commencez par un réactif de couleur aqueux contenant de l’iodure de potassium, de l’iode et du chlorure de calcium. Dans des conditions aqueuses, l’iodure de potassium et l’iode produisent des ions iodure.

Dans des tubes de microcentrifugation séparés, mélangez le réactif avec des polysaccharides de structures de branches connues et un échantillon de glycogène de structure non caractérisée.

Les polysaccharides adoptent des structures hélicoïdales via leurs liaisons alpha-1,4-glycosidiques. Les ions iodure se lient à ce noyau hélicoïdal, formant des chaînes polyiodures linéaires. Il en résulte la formation de complexes de transfert de charge entre les polysaccharides et les chaînes de polyiodures, ce qui donne des complexes polysaccharides-iodure colorés.

Les polysaccharides non ramifiés avec des chaînes polyiodures plus longues développent une couleur bleue, tandis que les polysaccharides ramifiés avec des chaînes polyiodures plus courtes développent des complexes jaunâtres à brun-orange. Le chlorure de calcium contenu dans le réactif intensifie la couleur complexe.

Transférez le mélange dans des cuvettes jetables. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez le spectre d’absorbance de 330 à 800 nanomètres.

Les complexes non ramifiés de couleur bleue absorbent la lumière à des longueurs d’onde plus longues, démontrant un décalage vers la droite des maxima d’absorbance. En revanche, les complexes ramifiés absorbent la lumière à des longueurs d’onde plus courtes, le décalage vers la gauche des maxima d’absorbance indiquant une ramification plus élevée de la structure.

Les maxima d’absorbance de l’échantillon de glycogène non caractérisé à environ 450 nanomètres confirment sa structure ramifiée.

Pour déterminer la ramification du glycogène, combinez 650 microlitres de réactif de couleur iode/chlorure de calcium avec 100 microlitres d’eau dans un tube de 1,5 millilitre, et mélangez soigneusement la solution avant de la transférer dans une cuvette en méthacrylate jetable. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre pour effectuer un essai en mode de balayage de longueur d’onde pour collecter le spectre de fond de 330 à 800 nanomètres.

Dans un tube séparé de 1,5 millilitre, combinez 650 microlitres du réactif de couleur iode/chlorure de calcium avec 50 microgrammes de glycogène d’huître, et complétez le volume final à 750 microlitres avec de l’eau. Après avoir bien mélangé le mélange, transférez la solution dans une cuvette en méthacrylate jetable pour recueillir un spectre d’absorption de 330 à 800 nanomètres.

De même, obtenez un spectre d’absorption avec 50 microgrammes d’amylopectine et 30 microgrammes d’amylose comme décrit précédemment.

Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combinez 25 à 50 microgrammes de glycogène avec 650 microlitres du réactif de couleur iode/chlorure de calcium de travail, et procédez comme expliqué précédemment pour acquérir le spectre d’absorption.