5-Methylcytosine dot Blot pour déterminer l’étendue de la méthylation de l’ADN

La méthylation de l’ADN est une modification épigénétique qui implique l’ajout d’un groupe méthyle à la base cytosine de l’ADN pour former la 5-méthylcytosine. Cette modification modifie l’expression des gènes.

Pour quantifier la méthylation de l’ADN par dot-blot, prélevez des échantillons d’ADN génomique dérivé de chondrocytes humains à différents stades de dédifférenciation qui présentent différents niveaux de cytosine méthylée.

Traitez les échantillons d’ADN avec de l’hydroxyde de sodium – un alcali puissant – et chauffez-les. Ce traitement brise les liaisons hydrogène entre les deux brins d’ADN, entraînant une dénaturation de l’ADN. Ajoutez de l’acétate d’ammonium pour neutraliser l’alcali, empêchant ainsi une dégradation excessive de l’ADN.

Prenez une membrane en nylon et repérez les échantillons d’ADN dénaturés sous forme de points. L’ADN chargé négativement se lie à la membrane de nylon chargée positivement via des interactions électrostatiques, ce qui entraîne son transfert sur le support solide.

Traitez la membrane tamponnée avec un tampon de blocage pour éviter une liaison non spécifique. Ensuite, ajoutez des anticorps anti-5-méthylcytosine à la membrane et incuberez. Ces anticorps se lient exclusivement à la cytosine méthylée de l’ADN.

Lavez pour éliminer les anticorps non liés et ajoutez des anticorps secondaires conjugués à des enzymes chimiluminescentes qui se lient spécifiquement aux anticorps primaires.

Ajoutez un substrat chimiluminescent sur la membrane. L’enzyme de l’anticorps réagit avec le substrat pour produire une chimiluminescence, ce qui produit des points de différentes intensités.

Imagez la membrane et mesurez l’intensité des points, ce qui correspond à l’étendue de la méthylation de l’ADN dans chaque échantillon.

Commencez cette procédure en dénaturant l’ADN isolé dans de l’hydroxyde de sodium de 0,1 molaire pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius. Neutralisez l’ADN avec 1 molaire d’acétate d’ammonium sur glace, puis diluez deux fois avec de l’eau distillée deux fois.

L’étape la plus critique du dot blot est le repérage des échantillons sur la membrane, faites-le lentement et soigneusement. Essayez de réduire chaque zone tachetée à 3 à 4 millimètres de diamètre.

À l’aide d’une pointe de pipette à ouverture étroite, repérez soigneusement 2 microlitres d’ADN génomique dilué en série sur une membrane de nylon chargée positivement au centre de la grille. Épongez la membrane à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, bloquez les sites de liaison des anticorps non spécifiques en trempant la membrane dans 5 % de BSA dans du TBST dans une boîte de Pétri de 10 centimètres pendant 1 heure à température ambiante avec une légère agitation.

Après 1 heure, lavez la membrane trois fois dans du TBST pendant 5 minutes à chaque fois. Incuber la membrane avec un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine de souris dans du TBST à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez la membrane trois fois dans du TBST pendant 5 minutes à chaque fois.

Ensuite, incubez avec un anticorps secondaire - l’immunoglobuline G de mouton conjuguée à la peroxydase de raifort dans TBST pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé la membrane dans TBST comme précédemment, ajoutez le substrat enzymatique à la membrane et incubez pendant 5 à 10 minutes. Enfin, visualisez le signal de l’anticorps secondaire à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon les instructions du fabricant.