Technique d’évaluation de l’effet inhibiteur de l’exposition à des toxines sur les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSC)

Traiter les cultures neuronales avec des concentrations croissantes d’une toxine d’essai.

La toxine pénètre dans les cellules et est libérée dans le cytosol.

Selon son potentiel, la toxine peut empêcher la fusion vésiculaire, inhibant la libération de neurotransmetteurs.

Remplacez le milieu par un tampon contenant des composés neuropharmacologiques spécifiques pour bloquer les potentiels d’action neuronale.

Placez la boîte de culture sur une platine d’électrophysiologie. Pour commencer l’enregistrement, connectez un soma neuronal à une pipette contenant une électrode d’enregistrement.

Appliquez une pression négative constante pour aspirer une petite partie de la membrane, formant un gigaseal, un joint étanche qui garantit un minimum d’interférences pendant l’enregistrement.

Maintenir une tension membranaire constante pour mesurer les courants neuronaux.

Appliquez des impulsions de pression négative pour rompre la membrane, établissant un contact direct entre le neurone et la pipette.

Enregistrez les courants produits dans le neurone en raison de l’absorption de neurotransmetteurs, appelés mEPSC.

Une diminution de la fréquence des mEPSC avec une exposition accrue aux toxines indique l’inhibition de la libération de neurotransmetteurs.

Diluer la neurotoxine botulique de sérotype A à 100 fois la concentration finale souhaitée dans un milieu de culture ESN et à chaud à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez un volume approprié de toxine aux cultures DIV 21+ ESN. Faites tourner la boîte de culture et retournez-la dans l’incubateur.

Au moment souhaité, aspirez le milieu de culture ESN et lavez-le deux fois avec un tampon d’enregistrement extracellulaire ou ERB. Ensuite, ajoutez 4 millilitres d’ERB complété par 5 tétrodotoxine micromolaires pour bloquer les potentiels d’action et 10 millilitres de biculline micromolaire pour antagoniser l’activité du récepteur GABA_A. Ensuite, transférez la parabole sur le dispositif d’électrophysiologie. Ni la perfusion ni le contrôle de la température ne sont nécessaires pour l’inhibition mesurée de la transmission synaptique ou le dosage de la TSM.

Après avoir utilisé un extracteur de micropipette pour tirer des pipettes en borosilicate avec une résistance de 5 à 10 mégaohms, remplissez une pipette avec un tampon d’enregistrement intracellulaire. Ensuite, trempez doucement la pipette dans le réactif de siliconation. Fixez la pipette d’enregistrement sur le porte-électrode et fixez une seringue remplie d’air au tube qui est inséré dans le porte-électrode. Fournir une pression positive constante via la seringue tout en abaissant la pipette d’enregistrement dans l’ERB.

Après avoir posé doucement la pipette d’enregistrement sur le soma du neurone à enregistrer, saisissez la pression positive en brisant le sceau de la seringue. Rebranchez la seringue et appliquez une pression négative soutenue par inspiration douce pour former un joint gigaohm. Une fois le joint gigaohm formé, diminuez la tension de maintien à moins 70 millivolts, puis appliquez soigneusement de courtes impulsions de pression négative à l’aide de la seringue pour passer en configuration en gros.

Surveillez les pics de capacité pendant 30 secondes pour confirmer que le correctif est stable. Annulez les pics de capacité dans le logiciel de piratage et passez en mode de pince de courant pour surveiller et enregistrer le potentiel de la membrane au repos. Sans ajustement pour les potentiels de jonction liquide, le potentiel de la membrane au repos doit être compris entre moins 67 et moins 82 millivolts.

Ajustez le gain à 2 millivolts par picoampère. Passez en mode pince de tension et effectuez un enregistrement continu de moins 70 millivolts, en enregistrant pendant 3 à 5 minutes pour détecter des courants postsynaptiques excitateurs miniatures.

Analysez 3 à 5 minutes de données enregistrées pour détecter les MEPSC en utilisant les paramètres par défaut des EPSC du récepteur AMPA dans la mini-analyse. Collectez et enregistrez des informations sur les événements détectés. Après avoir recueilli les fréquences du mEPSC pour 8 à 12 témoins et 8 à 12 échantillons traités à la neurotoxine botulique pour chaque condition d’exposition, analyser la fréquence en fonction de l’âge et des témoins appariés par lot.