Un test pour mesurer les titres d’anticorps d’inhibition de la neuraminidase de la grippe

Prenez des puits à plaques multi-puits recouverts d’une glycoprotéine qui agit comme un substrat pour la neuraminidase ou NA, protéines de surface du virus de la grippe.

Ajouter du sérum humain inactivé par la chaleur dilué en série contenant des anticorps inhibiteurs de NA dans les puits d’essai et des milieux seuls dans le puits de contrôle.

Introduire le virus et incuber.

Dans le puits témoin, le NA viral clive l’acide sialique terminal de la glycoprotéine, exposant l’avant-dernier galactose. Dans les puits d’essai, la liaison des anticorps inhibe l’activité NA.

Retirez le mélange virus-sérum. Ajoutez des conjugués lectine-peroxydase, qui se lient au galactose exposé.

Retirez les conjugués non liés et ajoutez un substrat de peroxydase chromogène mélangé à du peroxyde d’hydrogène.

La peroxydase immobilisée utilise du peroxyde d’hydrogène pour oxyder le substrat en un produit coloré.

Ajoutez de l’acide pour abaisser le pH, arrêtant ainsi la réaction.

Mesurez la densité optique et calculez le pourcentage d’inhibition NA.

L’inverse de la dilution sérique nécessaire pour l’inhibition de la NA à cinquante pour cent est le titre de l’anticorps inhibiteur de la NA.

Chauffez et activez les échantillons de sérum dans un bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. Décongeler un flacon de virus, de vortex et le remettre en suspension dans le diluant de l’échantillon à la dilution choisie. Préparez au moins 5 millilitres de virus pour chaque plaque de dosage.

Conservez le virus dilué sur de la glace jusqu’à ce que les plaques soient lavées et que des échantillons de sérum aient été ajoutés à la plaque. Préparez les dilutions des échantillons de sérum et de tous les témoins, en effectuant des dilutions en deux séries dans une plaque à fond rond de 96 puits, en commençant par une dilution de 1 sur 10 dans le diluant de l’échantillon.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 50 microlitres de chaque contrôle sérique ou dilution d’échantillon de la plaque de dilution dans des puits dupliqués d’une plaque lavée recouverte de fétuine. La dilution de l’échantillon doit être ajoutée dans les colonnes 2 à 11. Ajouter 50 microlitres de virus dilué dans tous les puits, à l’exception du témoin négatif de la colonne 12.

Ajoutez 50 microlitres de diluant d’échantillon dans les puits de la colonne 1 et ajoutez 100 microlitres de diluant d’échantillon dans la colonne 12. Couvrez les puits avec une scelleuse de plaques, puis mélangez en tapotant doucement les côtés de la plaque ou en la plaçant sur un agitateur de plaques à vitesse modérée pendant 10 secondes.

Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Lorsque l’incubation nocturne est terminée, laver la plaque avant d’ajouter le PNA-HRPO et terminer le test comme précédemment. Lisez la densité optique à 490 nanomètres et confirmez que les résultats du test sont valides. Déterminez le titre du point final de 50 %, comme décrit dans le protocole textuel et la section des résultats.