Génération d’une culture primaire d’astrocytes à partir du cerveau d’un petit rat

Ajoutez un cortex du cerveau d’un petit rat à un tube avec un tampon.

À l’aide d’une pipette, déplacez doucement le cortex de haut en bas pour le briser en petits morceaux de tissu.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettre les morceaux en suspension dans un milieu de culture.

Passez les morceaux dans des aiguilles de diamètres décroissants pour obtenir une suspension unicellulaire.

Transférez les cellules dans une plaque recouverte de polypeptides contenant le milieu de culture et incuberez.

Les astrocytes adhèrent fortement aux surfaces recouvertes de polypeptides, facilitant leur croissance sur d’autres cellules.

Retirez le milieu et lavez-le avec un tampon pour éliminer les cellules mal fixées.

Traiter avec une enzyme digestive pour détacher les astrocytes de la plaque.

Ajouter le milieu pour arrêter l’activité enzymatique.

Recueillir le surnageant dans un tube et centrifuger.

Jetez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans un milieu de culture frais.

Placez les cellules dans une plaque et incubez pour faciliter la multiplication des astrocytes.

Transférez le cortex dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de PBS froid, et homogénéisez le tissu en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois avec une pointe d’un millilitre. Centrifugez les cellules à 500 g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans trois millilitres de PBS froid en le pipetant avec une pointe d’un millilitre.

Centrifugez à nouveau et mettez à nouveau en suspension la pastille dans deux millilitres de DMEM complet, complété par 10 % de FBS et des antibiotiques. Après avoir transféré l’homogénat dans un tube de deux millilitres, passez l’homogénat à travers des aiguilles de calibre 21 et 23 pour former une suspension de cellules simples. Versez la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant trois millilitres de DMEM complet, et secouez légèrement la boîte de Pétri pour que la suspension soit uniformément répartie. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air à 37 degrés Celsius.

Pour favoriser la croissance des astrocytes, retirez l’ancien milieu et lavez la cellule avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS, une fois qu’elles atteignent une confluence de 70 à 80 %. Ensuite, essayez de tester la couche sous-jacente d’astrocytes en ajoutant un millilitre de solution de trypsine préchauffée et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.

Utilisez un microscope pour vérifier si les cellules commencent à se détacher et ajoutez quatre millilitres de DMEM complet. Récupérez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube à 500 g pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, préparez le plat de culture et ajoutez le milieu de culture. Replaquez les cellules à une densité de 10^{à 4} cellules par centimètre carré dans cinq millilitres de DMEM frais et complet, et lavez les cellules avec du DMEM complet avant chaque remplacement de support.