Isolement et culture de neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

Prenez un cerveau de bébé souris fraîchement récolté.

Séparez le cervelet et retirez sa couche membraneuse.

Du côté ventral, retirez le réseau de vaisseaux sanguins.

Coupez le cervelet en fragments et transférez-les dans un tube contenant un tampon.

Centrifugez et jetez le surnageant contenant les débris.

Ajoutez de la trypsine, une enzyme protéolytique, pour digérer la matrice extracellulaire du tissu et détacher les cellules.

Ajoutez un tampon contenant un inhibiteur de la trypsine et de la DNase.

L’inhibiteur arrête l’activité de la trypsine tandis que la DNase dégrade tout ADN contaminant.

Dissocier mécaniquement le tissu pour former une suspension cellulaire, y compris les neurones granulaires cérébelleux et les cellules non neuronales ou gliales.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube.

Ajouter un tampon. Centrifugez et retirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans le milieu et les déposer sur des plaques de culture recouvertes de poly-D-lysine.

Les cellules se fixent aux surfaces revêtues.

Ajoutez un antimétabolite pour éliminer les cellules gliales proliférantes et générer une culture pure de neurones granulaires cérébelleux.

Pour isoler le cervelet, placez le cerveau dans la solution de dissection complétée par du sulfate de magnésium, et gardez la solution et le cerveau sur de la glace.

Sous un microscope de dissection, retirez les méninges à l’aide d’une pince fine. Ensuite, disséquez le cervelet du cerveau dans une solution de dissection supplémentée en sulfate de magnésium. Cela aide à décoller les méninges restantes et permet d’aller entre les couches pour nettoyer les plis cérébelleux.

La présence de méninges dans la culture neuronale entraîne des cellules malsaines et finalement la mort cellulaire. En tant que tel, il est important d’assurer l’élimination complète des méninges avant de procéder à la culture.

Après cela, tournez le cervelet vers sa face ventrale et assurez l’ablation du plexus choroïde. Ensuite, mettez le cervelet dans une boîte de 35 millimètres contenant 1 millilitre de solution de dissection supplémentée en sulfate de magnésium. Coupez les tissus en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de solution de dissection tamponnée au sulfate de magnésium.

Dans cette étape, centrifugez le tube de 50 millilitres contenant le tissu cérébral haché pendant cinq minutes à 644 fois g et 4 degrés Celsius. Après cela, retirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de solution de dissection de trypsine. Ensuite, secouez la table à grande vitesse pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ajoutez 10 millilitres de solution d’inhibiteur de trypsine I dans le tube et secouez doucement pendant deux minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 644 fois g et 4 degrés Celsius. Après cinq minutes, retirez le surnageant et ajoutez 2 millilitres de solution d’inhibiteur de trypsine II avant de la transférer dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, triturez le tissu dans le tube de 15 millilitres jusqu’à ce que la solution devienne trouble. Laissez reposer pendant cinq minutes. Retirez ensuite le surnageant transparent et transférez-le dans un nouveau tube contenant 1 millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium.

Ajoutez encore 2 millilitres d’inhibiteur de trypsine solution-II au fond du tube contenant la pastille. Triturez-le à nouveau et laissez-le reposer pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube contenant le surnageant de l’étape précédente. Répétez ce processus jusqu’à ce que la majeure partie du tissu soit dissociée mécaniquement.

Ajouter 0,3 millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium à la collection de surnageant pour chaque millilitre de surnageant. Mélangez le contenu du tube puis centrifugez pendant cinq minutes à 644 fois g à température ambiante. Ensuite, retirez le surnageant. Ajouter 10 millilitres de milieu frais à la pastille et mélanger.

Ensuite, comptez les cellules vivantes et diluez-les à une concentration de 1,5 x 10⁶ cellules par millilitre. Plaquez les cellules sur les plaques de poly-D-lysine préalablement préparées. Pour les plaques à quatre puits, placez 0,5 millilitre de l’échantillon, ce qui donne 7,5 x 10⁵ cellules par puits. Pour les plats de 35 millimètres, plaquez 4 millilitres de l’échantillon, ce qui donne 6 x 10⁶ cellules par plaque. Pour les lamelles, plaquez 0,5 ml, ce qui donne^7,5 x 10 5 cellules par puits.

Après 24 heures, ajoutez AraC deux plaques pour réduire la contamination gliale. Si les cellules doivent être maintenues pendant sept à huit jours, répétez ce traitement le jour 3 et maintenez les cultures dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 degrés Celsius.