Isolement et culture de motoneurones oculomoteurs, trochléaires et spinaux à partir d’un embryon de souris

Prenez une souris transgénique enceinte et retirez chirurgicalement l’utérus avec des embryons contenant des motoneurones marqués par fluorescence.

Transférez l’utérus dans une boîte avec un tampon glacé sous un microscope à fluorescence.

Utilisez la lumière visible pour isoler les embryons.

Retirez le visage et la queue des embryons et orientez-les en position couchée.

À l’aide du signal de fluorescence, faites une incision au niveau du mésencéphale pour exposer les noyaux oculomoteur et trochléaire, qui contiennent des motoneurones.

Isolez le mésencéphale contenant les noyaux.

Ouvrez la face dorsale du cerveau postérieur et de la moelle épinière. Isolez la moelle épinière, excisez les deux extrémités et collectez les colonnes contenant les motoneurones de la colonne vertébrale.

Traitez les tissus collectés avec des enzymes pour dissocier la matrice tissulaire. Récoltez les cellules uniques et isolez les neurones marqués par fluorescence à l’aide de FACS.

Ajoutez un milieu de culture aux neurones isolés, transférez les cellules sur une microplaque recouverte d’un substrat de culture et incubez, permettant aux cellules d’adhérer et de se développer.

Maintenir les motoneurones en culture.

Commencez par récolter des embryons EGF positifs à l’îlot-1 d’une souris enceinte environ 11,5 jours après la fécondation. Vaporisez abondamment l’abdomen avec de l’éthanol et retirez l’utérus avec des ciseaux de microdissection stériles et une pince à pansement. Lavez brièvement l’utérus dans du PBS stérile. Ensuite, transférez-le sur la plaque de dissection remplie de PBS stérile pré-réfrigéré.

Sous la lumière vive du microscope, retirez soigneusement les embryons de l’utérus à l’aide de ciseaux de microdissection, d’une pince à pansement pour le pouce et d’une pince à épiler numéro 5 de Dumont. Ensuite, utilisez une mini-cuillère perforée Moria stérile pour transférer chaque embryon dans un puits séparé d’une plaque de 24 puits remplie d’un milieu à faible fluorescence Hibernate E pré-refroidi complété par 1X V27.

Tout en gardant la plaque sur de la glace, transférez un embryon dans une plaque de dissection stérile et couvrez-le complètement avec une solution saline équilibrée de Hank stérile ou HBSS glacée. Utilisez une pince à épiler pour enlever le visage de l’embryon et la queue sans endommager le mésencéphale. Ensuite, placez l’embryon couché, les membres à cheval et la queue pointant vers l’avant du microscope.

À l’aide d’une pince à épiler, fendez le toit du quatrième ventricule afin de générer une petite ouverture. Utilisez cette ouverture pour accrocher une pince à épiler dans l’espace créé entre le quatrième ventricule et son toit. Disséquer le long de la surface dorsale de l’embryon rostral jusqu’au cortex et latéralement à la plaque de sol et à la colonne motrice.

Ensuite, ouvrez le tissu disséqué à livre ouvert pour révéler les noyaux CN3 et CN4 positifs à la GFP. Séparez soigneusement le mésencéphale ventral de l’embryon et retirez le tissu méningé à l’aide d’une pince à épiler et d’un couteau de microdissection.

Disséquez les noyaux bilatéraux CN3 et CN4 positifs à la GFP loin de la plaque de sol et des autres tissus environnants positifs à la GFP, en prenant soin d’éviter de toucher ou d’endommager les neurones. Si vous prélevez des noyaux CN3 et CN4 séparés, coupez le long du mésencéphale de ces deux noyaux et utilisez une pipette P1000 pour prélever le tissu du mésencéphale ventral disséqué avec un HBSS minimal.

Placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre étiqueté rempli de milieu de dissection. Conservez le tube sur de la glace jusqu’à dissociation. Continuez à regrouper les mésencéphales ventrales d’embryons supplémentaires dans le même tube jusqu’à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales.

Pour disséquer la moelle épinière ventrale, gardez l’embryon couché avec la tête tournée vers l’avant du microscope. Tenez-le avec une pince à épiler et insérez la pointe de l’autre paire dans la partie caudale non ouverte du quatrième ventricule. Ouvrez le reste du cerveau postérieur et de la moelle épinière dorsalement sur toute l’étendue rostrocaudale de l’embryon. Coupez le tissu dorsal en commençant par le quatrième ventricule et en allant vers le canal central de la moelle épinière caudale, en utilisant la pince comme des ciseaux.

Ensuite, tenez l’embryon avec une pince à épiler et pincez le rabat du tissu dorsal de chaque côté avec l’autre paire. Retirez la moelle épinière ventrale à l’aide du couteau de microdissection pour percer directement sous le SMN positif à la GFP, en soulevant la moelle épinière ventrale avec des mouvements en forme de scie des deux côtés.

Coupez la moelle épinière transversalement à la limite supérieure du membre inférieur et retirez la partie lombaire cervicale. Coupez transversalement directement au-dessus de C1 où la première corne antérieure GFP positive se projette. Placez la moelle épinière ventrale côté dorsal vers le haut et maintenez-la en pressant le tissu GFP-négatif entre les colonnes SMN GFP-positives avec une pince à épiler.

Retirez le mésenchyme attaché, les DRG et la moelle épinière dorsale restants en coupant les deux côtés de la colonne SMN GFP positive avec le couteau de microdissection. À l’aide d’une pipette P1000, prélevez le tissu de la moelle épinière ventrale disséqué avec un HBSS minimal, et placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre rempli de milieu de dissection. Conservez-le sur de la glace jusqu’à la dissociation et continuez à regrouper les moelles épinières ventrales des embryons supplémentaires dans le même tube.

Ajouter le volume approprié de solution de papaïne dans chacun des tubes de microcentrifugation contenant les échantillons de tissus disséqués. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en agitant les tubes toutes les 10 minutes en effleurant les doigts.

Après l’incubation, triturez doucement chaque suspension huit fois avec une pipette P200. Centrifugez-le à 300 fois g pendant cinq minutes. Remettez en suspension les culots cellulaires avec le volume approprié de solution d’inhibiteur d’albumine ovomucoïde en pipetant doucement de haut en bas. Répétez la centrifugation. Ensuite, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette P1000. Remettez les cellules en suspension dans le volume approprié de milieu de dissection. Filtrez les suspensions à travers des crépines à cellules de 70 micromètres.

Ensuite, utilisez le tri FACS pour isoler les cellules GFP positives disséquées à partir de CN3, CN4 et SMN. Diluez les suspensions cellulaires isolées avec un milieu de culture de motoneurones préchauffé à 37 degrés Celsius aux densités appropriées, et ajoutez 200 microlitres de la suspension dans un puits d’une plaque à 96 puits recouverte de laminine PDL. Cultivez les neurones dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en veillant à rafraîchir le milieu de culture des motoneurones tous les cinq jours.