Génération d’un explant ganglionnaire racinaire dorsal et d’une culture cellulaire dissociée

Commencez par les tissus ganglionnaires de la racine dorsale ou DRG dans un milieu sans sérum. Le tissu DRG contient des neurones sensoriels et des cellules gliales satellites intégrées dans la matrice extracellulaire, ECM.

Semez-les dans une boîte de culture recouverte d’un mélange de protéines gélatineuses pour améliorer l’adhérence des tissus.

Au fil du temps, les cellules gliales libèrent des facteurs de croissance neurotrophiques qui permettent des extensions neuronales, établissant une culture d’explant DRG.

Pour développer une culture cellulaire dissociée, prélevez ces explants de DRG dans un tube. Traitez-les avec de la collagénase pour dégrader la MEC, puis avec de la trypsine, qui perturbe les connexions cellulaires, libérant les neurones et les cellules gliales.

Ajouter un milieu enrichi en sérum pour arrêter la réaction enzymatique.

Pipetez le contenu à plusieurs reprises pour créer une suspension unicellulaire et filtrez-la pour éliminer les débris.

Centrifugez cette suspension cellulaire et retirez le surnageant contenant l’enzyme.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu neurobasal et transférez-les sur une plaque recouverte de laminine.

Les cellules gliales satellites et les neurones sensoriels adhèrent à la plaque recouverte de laminine, établissant une culture cellulaire dissociée.

Transférez chaque DRG dans une boîte de Pétri en verre sèche. Sous un microscope chirurgical, nettoyez et coupez les fibres en excès et le tissu conjonctif encore attachés au DRG à l’aide d’une lame. Le DRG est facilement identifiable comme une structure bombée et transparente le long du nerf rachidien blanc et des vaisseaux sanguins sont souvent trouvés autour du DRG.

Après cela, placez le nettoyé dans DRG dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un milieu glacé et sans sérum. Diluez le mélange de protéines gélatineuses dans un milieu glacé et sans sérum dans un rapport de 1 pour 1. Ensuite, plaquez le DRG ex vivo dans les plaques à 12 puits, pré-enrobées de 10 ou 20 microlitres de mélange de protéines gélatineuses, et maintenez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.

Maintenant, ajoutez doucement 1,5 à 2 millilitres de milieu sans sérum au système de culture pour couvrir tout l’explant et maintenir les explants dans des conditions de culture. Changez le milieu de croissance DRG toutes les 72 heures. et laisser le DRG se développer aussi longtemps que nécessaire.

Il s’agit d’une étape critique car le DRG est ancré à la plaque de verre à l’aide du mélange de protéines gélatineuses. Par conséquent, le temps de polymérisation et les compétences de pipetage sont essentiels pour éviter de flotter.

Dans cette procédure, placez tout le DRG recueilli dans un tube stérile de 1,5 millilitre avec un milieu F12 contenant de la collagénase IV, et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, remplacez le milieu frais contenant de la collagénase IV et incubez l’échantillon pendant 45 minutes supplémentaires. Ensuite, traitez les explants avec 2 millilitres de milieu F12 contenant 0,025 % de trypsine à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Immédiatement après le traitement à la collagénase IV, incubez-les avec 2 millilitres de milieu F12 contenant du sérum fœtal bovin à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les explants trois fois avec 2 millilitres de média F12, et procédez à leur dissociation mécanique avec une pipette en verre, jusqu’à ce que le média devienne trouble.

Ensuite, filtrez la culture cellulaire dissociée à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer toutes les impuretés et l’excès de tissu conjonctif. Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire filtré pendant deux minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de milieu neurobasal. Placez les cellules dissociées sur des lames de couverture recouvertes de laminine à une densité cellulaire préférée.