Isolement des neurones sensoriels et co-culture avec des cellules tueuses naturelles

Prenez un ganglion de la racine dorsale ou DRG, un groupe de neurones sensoriels, dans un milieu froid contenant du sérum pour protéger les neurones pendant le traitement ultérieur.

Centrifugez, puis retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon phosphate contenant des enzymes digestives et incubez avec une légère agitation.

Les enzymes dissocient la matrice extracellulaire, ou ECM, et le tissu DRG, relâchant ainsi les cellules.

Ajoutez un milieu contenant du sérum pour inactiver les enzymes.

Centrifugez, puis jetez le surnageant.

Remettre le DRG en suspension et dissocier mécaniquement le tissu à l’aide de pipettes de tailles progressivement plus petites pour obtenir une suspension cellulaire.

Superposez les cellules sur un gradient de densité d’albumine sérique bovine.

centrifugeuse. Les neurones se déposent au fond, formant une cuille.

Jetez les couches contenant des débris de tissus.

Remettez les neurones en suspension dans un milieu de culture.

Ajoutez les neurones dans une boîte de culture recouverte d’ECM et incuber.

Retirez le milieu et ajoutez des cellules tueuses naturelles ou NK.

Ajoutez un milieu de co-culture et étudiez l’interaction entre ces cellules.

Récoltez les DRG dans un tube conique de 15 millilitres rempli de 10 millilitres de DMEM supplémentaire glacé. Ensuite, centrifugez la préparation pendant 5 minutes à 200 g à température ambiante, et retirez le surnageant. Ajoutez 250 microlitres de PBS contenant 1 milligramme par millilitre de collagénase IV et 2,4 unités par millilitre de Dispase également. Incuber ce DRG avec une solution de dispase de collagénase pendant 80 minutes en agitant doucement.

Pour inactiver les enzymes, ajoutez 5 millilitres de milieu DMEM supplémenté et centrifugez la solution à 200 g. Après 5 minutes, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et laissez environ 100 microlitres de surnageant pour éviter une perte cellulaire indésirable. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de DMEM supplémenté dans les cellules et utilisez un pistolet à pipette et trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes pour triturer doucement le DRG en une préparation unicellulaire.

À l’aide d’une pipette P200, ajoutez la suspension de ganglions triturés contenant les neurones sur le côté du tube dans le gradient BSA. Ensuite, réglez l’accélération et la décélération au minimum pour centrifuger le neurone contenant le gradient BSA pendant 12 minutes à 200 g. Après la centrifugation, prélever tout le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension les cellules dans 500 microlitres de neurobasal.

Plaque 10 000 neurones par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits recouverte de laminine. Pour permettre la fixation des neurones, incubez la plaque à 96 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour commencer la co-culture, retirez lentement le neurobasal de la culture de neurones et ajoutez 10 à⁵ cellules NK par puits à la culture de neurones.