Différenciation de cellules souches pluripotentes induites en cellules progénitrices neurales

Prenez une microplaque contenant une culture adhérente de fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF, dans un milieu.

Les MEF collés fonctionnent comme une couche nourricière, fournissant un microenvironnement de culture cellulaire favorable.

Retirez le milieu et introduisez des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou hiPSC, dans un milieu hiPSC complété par de petites molécules qui améliorent la survie cellulaire.

Incuber pour permettre aux hiPSC d’adhérer à la couche nourricière, qui sécrète des facteurs de croissance qui facilitent la prolifération des hiPSC.

Retirez le milieu et ajoutez une solution enzymatique pour détacher les cellules. Transférez les cellules et centrifugez-les, puis retirez le surnageant et mettez-les en suspension dans le milieu hiPSC.

Transférez les cellules sur une plaque recouverte de biopolymère. Incuber pour permettre aux MEF d’adhérer.

Transférez les hiPSC suspendus dans une microplaque à fond en V. Centrifuger les cellules et les incuber, induisant la formation d’agrégats cellulaires.

Se réapprovisionner avec un milieu de différenciation. Les nutriments du milieu et les interactions cellule-cellule au sein de l’agrégat facilitent la différenciation des hiPSC en cellules progénitrices neurales.

Pour ce protocole, commencez par établir des cellules nourricières. Pour établir cette culture, placez 600 000 cellules nourricières dans chaque puits d’une plaque à six puits, avec 300 millilitres de milieu par puits. Après avoir cultivé les cellules nourricières pendant 48 heures, remplacez le milieu et incubez les plaques pendant une heure, tout en préparant les cellules souches.

Décongelez les cellules souches dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois décongelées, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez le tube à 5 millilitres avec du milieu de culture, ajouté goutte à goutte. Ensuite, centrifugez doucement les cellules pendant quatre minutes. Aspirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de cellules souches avec inhibiteur de ROCK.

Après avoir quantifié la densité cellulaire, placez 300 000 cellules souches sur les cellules nourricières. Ensuite, cultivez et élargissez les cultures, en sélectionnant périodiquement des cellules saines. Après l’expansion et la congélation des cellules pour la sauvegarde, faites croître les colonies de cellules souches sur des plaques standard jusqu’à ce qu’elles atteignent 50 % à 70 % de confluence.

Ensuite, utilisez un traitement enzymatique doux et un titrage doux avec une pointe de pipette de 1 millilitre pour récolter les HIPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neurales. Centrifugez doucement la suspension, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu iPSC humain de 5 millilitres. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 5 centimètres recouverte de gélatine à 0,1 % et incubez la plaque pendant une heure.

Au bout d’une heure, transférez les cellules non adhérentes dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, rincez doucement la plaque avec 3 millilitres de fluide et transférez-la dans le même tube. Ensuite, répétez l’étape de remise en suspension avec une centrifugation douce.

Ensuite, déterminez la densité cellulaire et placez les cellules dans une plaque en V à fond en V de 96 puits à faible adhérence à 9 000 cellules par puits. Maintenant, faites tourner la plaque pendant trois minutes et commencez à cultiver les cellules. Au cours des 14 prochains jours, tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu par un milieu frais de différenciation.