Différenciation de cellules souches pluripotentes induites en cellules progénitrices neurales
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:22 min • July 8th, 2025
Prenez une microplaque contenant une culture adhérente de fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF, dans un milieu.
Les MEF collés fonctionnent comme une couche nourricière, fournissant un microenvironnement de culture cellulaire favorable.
Retirez le milieu et introduisez des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou hiPSC, dans un milieu hiPSC complété par de petites molécules qui améliorent la survie cellulaire.
Incuber pour permettre aux hiPSC d’adhérer à la couche nourricière, qui sécrète des facteurs de croissance qui facilitent la prolifération des hiPSC.
Retirez le milieu et ajoutez une solution enzymatique pour détacher les cellules. Transférez les cellules et centrifugez-les, puis retirez le surnageant et mettez-les en suspension dans le milieu hiPSC.
Transférez les cellules sur une plaque recouverte de biopolymère. Incuber pour permettre aux MEF d’adhérer.
Transférez les hiPSC suspendus dans une microplaque à fond en V. Centrifuger les cellules et les incuber, induisant la formation d’agrégats cellulaires.
Se réapprovisionner avec un milieu de différenciation. Les nutriments du milieu et les interactions cellule-cellule au sein de l’agrégat facilitent la différenciation des hiPSC en cellules progénitrices neurales.
Pour ce protocole, commencez par établir des cellules nourricières. Pour établir cette culture, placez 600 000 cellules nourricières dans chaque puits d’une plaque à six puits, avec 300 millilitres de milieu par puits. Après avoir cultivé les cellules nourricières pendant 48 heures, remplacez le milieu et incubez les plaques pendant une heure, tout en préparant les cellules souches.
Décongelez les cellules souches dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois décongelées, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez le tube à 5 millilitres avec du milieu de culture, ajouté goutte à goutte. Ensuite, centrifugez doucement les cellules pendant quatre minutes. Aspirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de cellules souches avec inhibiteur de ROCK.
Après avoir quantifié la densité cellulaire, placez 300 000 cellules souches sur les cellules nourricières. Ensuite, cultivez et élargissez les cultures, en sélectionnant périodiquement des cellules saines. Après l’expansion et la congélation des cellules pour la sauvegarde, faites croître les colonies de cellules souches sur des plaques standard jusqu’à ce qu’elles atteignent 50 % à 70 % de confluence.
Ensuite, utilisez un traitement enzymatique doux et un titrage doux avec une pointe de pipette de 1 millilitre pour récolter les HIPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neurales. Centrifugez doucement la suspension, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu iPSC humain de 5 millilitres. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 5 centimètres recouverte de gélatine à 0,1 % et incubez la plaque pendant une heure.
Au bout d’une heure, transférez les cellules non adhérentes dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, rincez doucement la plaque avec 3 millilitres de fluide et transférez-la dans le même tube. Ensuite, répétez l’étape de remise en suspension avec une centrifugation douce.
Ensuite, déterminez la densité cellulaire et placez les cellules dans une plaque en V à fond en V de 96 puits à faible adhérence à 9 000 cellules par puits. Maintenant, faites tourner la plaque pendant trois minutes et commencez à cultiver les cellules. Au cours des 14 prochains jours, tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu par un milieu frais de différenciation.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de différencier des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) en cellules progénitrices neuronales en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) comme couche d'alimentation. Le processus comprend plusieurs étapes, notamment la culture cellulaire, le détachement et l'incubation afin de favoriser l'agrégation et la différenciation cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Neurosciences
- Techniques de culture cellulaire
Contexte
- Les CIPS ont la capacité de se différencier en divers types cellulaires.
- Les MEF offrent un environnement propice à la croissance des cellules souches.
- L'agrégation cellulaire est essentielle pour favoriser la différenciation.
- La compréhension des voies de différenciation est fondamentale pour la médecine régénérative.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour différencier les hiPSCs en cellules progénitrices neuronales.
- Utiliser les MEFs comme couche d'alimentation afin d'améliorer la survie et la prolifération cellulaire.
- Étudier les effets des conditions de culture sur la différenciation des cellules souches.
Méthodes utilisées
- Culture de MEF dans une plaque de six puits.
- Décongélation et mise en culture de hiPSC sur la couche de cellules nourricières MEF.
- Induction de l'agrégation cellulaire dans une microplaque en forme de V.
- Renouvellement du milieu avec des facteurs de différenciation pour favoriser la formation de cellules progénitrices neuronales.
Résultats principaux
- Mise en place réussie d'une couche d'alimentation pour la culture de hiPSC.
- Différenciation efficace des hiPSC en cellules progénitrices neuronales observée.
- L'agrégation cellulaire s'est révélée essentielle pour améliorer les résultats de différenciation.
- Des conditions optimales de culture ont été identifiées pour la croissance et la différenciation des cellules souches.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode robuste pour générer des cellules progénitrices neuronales à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs).
- Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) servent de couche d'alimentation efficace pour soutenir la culture des cellules souches.
- Des études ultérieures pourront explorer les applications des cellules différenciées dans la recherche et la thérapie.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La différenciation de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) en cellules progénitrices neuronales permet une détection mécanistique des risques lors de la validation précoce des cibles en neurosciences, en fournissant un système pertinent pour l'homme et facilement reproductible pour l'analyse des voies biologiques. Cette approche renforce la confiance prédictive dans l'identification des candidats principaux en modélisant les mécanismes du développement neuronal dans un contexte physiologique. Elle répond à un point critique de découverte où la pertinence biologique et la reproductibilité des tests influencent les décisions de tri du portefeuille.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans un système neuronal d'origine humaine afin de clarifier l'engagement de la cible et la modulation des voies.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique grâce à une différenciation standardisée des hiPSC en NPCs à l'aide d'une couche de cellules nourricières définie et d'étapes d'agrégation.
- Valeur prédictive : Soutient la réduction des risques en phase préclinique en générant des cellules neuronales pertinentes pour la maladie afin de valider la cible avant l'optimisation du composé leader.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des agrégats de cellules progénitrices neuronales reproductibles et évolutifs, adaptés au criblage de composés dans des microplaques à fond en V.
- Valeur opérationnelle : Met en place une étape d'agrégation sans sérum et indépendante des cellules nourricières, améliorant la standardisation des tests et minimisant la variabilité.
- Préparation du test : Permet des mesures quantitatives de l'efficacité de la différenciation et de l'expression des marqueurs, facilitant l'intégration dans des campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Fait le lien entre la découverte et le développement préclinique en générant des cellules neuronales humaines possédant un potentiel de modélisation des maladies pour la validation de cibles.
- Réduction du risque mécanistique : Fournit un système pertinent pour l'espèce humaine permettant d'évaluer la modulation de la voie cible et la réponse phénotypique en phase précoce de découverte.
- Continuité : Permet une évaluation longitudinale allant de la différenciation des cellules progénitrices neuronales à la maturation neuronale ultérieure, en vue d'une modélisation prédictive.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés d'intérêt, en fournissant un système neuronal humain évolutif permettant des criblages mécanistiques et phénotypiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules progénitrices neurales à l'aide d'une agrégation définie et d'un changement contrôlé de milieu.
- Criblage : Permet la préparation des tests grâce à la formation reproductible d'agrégats dans des plaques à fond en V et faible adhérence contenant un milieu de différenciation défini.
- Analytique : Facilite la mesure quantitative de l'expression des marqueurs neuronaux et de l'efficacité de la différenciation en tant que paramètres fonctionnels.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en générant des cellules nerveuses humaines utilisables pour la modélisation des maladies et la validation de cibles thérapeutiques.
- Réutilisation en milieu industriel : Met en place une plateforme de différenciation évolutive, soutenue par des cellules nourricières, applicable à plusieurs cibles et projets en neurosciences.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation des cibles grâce à la génération de cellules progénitrices neuronales pertinentes pour l'humain et à la réduction du risque de traduction entre espèces.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité par la suppression normalisée de la couche d'alimentation, l'agrégation et les étapes de différenciation.
- Valeur stratégique : Favorise de meilleures décisions d'orientation (go/no-go) en permettant une évaluation précoce des effets sur la cible dans un contexte neural humain.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque grâce à la réduction mécanistique des incertitudes et à la modélisation prédictive en découverte neuroscientifique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, en gestion des couches d'alimentation et en techniques de différenciation neuronale.
- Dépend de l'accès à des plaques V-bas V revêtues de biopolymères et à faible adhérence pour la formation d'agrégats.
- Exige une standardisation interéquipes du milieu de différenciation et du calendrier afin d'obtenir un rendement reproductible de cellules progénitrices neuronales (NPC).
- Implique des ajustements à prendre en compte lors du passage de plaques de 96 puits à des formats plus grands pour des applications de criblage.
- Limité par la durée de différenciation de 14 jours et la fréquence des changements de milieu, ce qui affecte la planification du débit.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026