Étude de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans

Commencez avec une plaque de gélose contenant des Caenorhabditis elegans transgéniques exprimant des protéines fluorescentes vertes ou GFP dans leurs neurones.

Ajoutez de l’eau stérile dans la plaque, faites-la tourner pour soulever les vers et transférez-les dans un tube.

Laissez les vers se déposer, puis retirez l’excès d’eau et remettez-les en suspension.

Transférez les vers remis en suspension dans une plaque enduite de pesticide et une plaque de contrôle sans pesticide, puis incuber.

Sur la base de leurs actions, le pesticide endommage spécifiquement certains neurones et provoque un gonflement neuronal, diminuant l’expression de la GFP.

Transférez les vers sur un tampon d’agarose contenant un agent anesthésique, puis placez une lamelle.

Montez la lame sur un microscope fluorescent. Tout d’abord, visualisez les vers à l’aide du mode de contraste de phase, puis passez en mode fluorescence.

Chez les vers traités aux pesticides, les neurones présentent une fluorescence réduite, des somas gonflés et des lacunes dans les processus neuronaux, indiquant des effets neurodégénératifs.

Lorsqu’ils sont sous contrôle, les neurones sains présentent un soma intact avec une fluorescence brillante.

À l’aide d’une micropipette, placez 1 millilitre d’eau stérile sur la plaque de nématodes. Ensuite, faites tourner l’eau pour soulever les nématodes. Ensuite, retirez le liquide avec les nématodes dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Après 10 minutes, au fur et à mesure que les nématodes se déposent par gravité, retirez soigneusement au moins 500 microlitres d’eau et jetez-le.

Ensuite, remettez les nématodes en suspension et, à l’aide d’une pointe de pipette jaune coupée, retirez 50 à 100 microlitres de vers en suspension dans chaque plaque de traitement, en vous assurant que chaque plaque contient au moins 10 vers adultes. Préparez deux lames en plaçant un morceau de ruban adhésif sur un seul côté de la diapositive pour former un tampon d’épaisseur uniforme.

Ensuite, placez une glissière propre et inutilisée entre eux sur le plan de travail. Placez une goutte de 10 microlitres d’agarose fondue au centre de la lame à l’aide d’une micropipette. Ensuite, aplatissez la goutte en plaçant une autre lame propre sur le dessus, perpendiculairement à la lame avec la goutte, et appliquez une pression pour que la goutte d’agarose forme l’épaisseur du ruban d’étiquetage.

Ensuite, appliquez une pression constante pour séparer les deux lames. Ensuite, posez la lame avec la gélose vers le haut sur le plan de travail et laissez-la sécher pendant une à deux minutes avant de l’utiliser. Pour ajouter des nématodes à la lame préparée avec le tampon d’agarose, ajoutez une goutte de 5 microlitres d’eau contenant 1 molaire d’azoture de sodium dans le tampon de gélose, ce qui anesthésiera les vers et les mobilisera.

Ensuite, transférez au moins 10 nématodes par lame de traitement dans la gouttelette à l’aide d’un pic à vers, qui doit être stérilisé avant et après le transfert des nématodes. Ensuite, ajoutez une lamelle à l’aide d’une pince en la plaçant à un angle et en l’abaissant lentement.

Ensuite, placez la monture humide préparée sur un microscope fluorescent pour observer les vers, d’abord sous un grossissement de 10x et un contraste de phase, puis sous un grossissement de 40x avec contraste de phase et éclairage fluorescent.

Placez un support humide préparé à la fois sur la platine du microscope et fixez-le en place à l’aide des clips de la platine du microscope. Ensuite, commencez à visualiser les montures humides avec l’objectif de grossissement le plus bas, qui est généralement de 10x, et utilisez un champ clair ou un contraste de phase pour visualiser et faire la mise au point sur les nématodes.

Une fois qu’un nématode est localisé dans le champ de vision, faites la mise au point sur celui-ci à l’aide du bouton de mise au point fin du microscope. Ensuite, passez l’éclairage en fluorescence en tournant le cadran et dirigez la lumière vers l’appareil photo pour capturer les images numériques.

Ensuite, ajustez l’éclairage à l’aide du logiciel d’imagerie afin que les neurones soient brillamment éclairés, mais pas sursaturés. À un moment donné, obtenez une image distincte d’une règle au même grossissement que les images de cellule pour fournir une échelle de grossissement à leur figure.