Imagerie calcique in vivo d’ensembles neuronaux dans les ganglions intacts de la racine dorsale d’une souris

Prenons l’exemple d’une souris transgénique anesthésiée avec un ganglion de la racine dorsale exposé, ou DRG, un groupe de corps cellulaires neuronaux sensoriels qui reçoivent des informations des membres postérieurs.

Les neurones du DRG expriment un indicateur de calcium cytoplasmique.

À l’aide d’un microscope confocal, visualisez le DRG pour imager l’activité collective d’un grand nombre de neurones.

Sans stimulation externe, le faible niveau de calcium intracellulaire maintient les indicateurs dans leur conformation native, ce qui entraîne une faible fluorescence de base.

Appliquez un stimulus mécanique ou thermique à une patte arrière, générant un potentiel d’action dans les neurones sensoriels.

Le signal se propage jusqu’au DRG, où les canaux calciques voltage-dépendants dans les neurones s’ouvrent, permettant l’afflux de calcium.

Les ions calcium supplémentaires se lient aux indicateurs, induisant un changement de conformation qui augmente l’intensité de la fluorescence.

Observez une fluorescence brillante dans le DRG, dont l’intensité correspond au nombre de neurones stimulés présentant un afflux de calcium.

Placez la souris sur un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Localisez l’élargissement lombaire en palpant l’os pelvien de la souris. Rasez ensuite le dos de la souris au-dessus de la zone d’élargissement lombaire. À l’aide de ciseaux, faites une incision rectangulaire sur trois côtés au-dessus de l’élargissement lombaire et repliez la peau avec une pince.

Utilisez les ciseaux de dissection à ressort de 13 millimètres pour faire des incisions de 3 à 4 millimètres sur le côté droit de la colonne vertébrale. Utilisez des ciseaux pour couper la peau et les muscles sur les côtés afin d’exposer la colonne vertébrale. Ensuite, à l’aide de ciseaux de 8 millimètres, coupez le muscle et le tissu conjonctif pour nettoyer l’apophyse transversale du côté droit L5 DRG.

Essayez de minimiser les saignements en utilisant du coton ou de la mousse de gel pour absorber le sang. Ouvrez l’apophyse transversale L5 du côté droit à l’aide de rongeurs Friedman-Pearson ou d’une pince fine et puissante, en prenant soin de ne pas toucher le DRG. Ensuite, déplacez la souris et le coussin chauffant sur la scène personnalisée. Utilisez du ruban adhésif de scène pour fixer l’animal et le coussin chauffant en place.

Placez le nez de l’animal dans le cône nasal pour une anesthésie continue à l’isoflurane. Fixez la patte arrière droite à une position hors de la scène pour faciliter l’application des stimuli. Fixez la colonne vertébrale en place avec les pinces de scène sur la peau des vertèbres ou de l’os pelvien, juste rostral et caudal au DRG L5. Ajustez les pinces et la platine pour que la surface du DRG soit aussi plane que possible.

Ensuite, placez la platine sous le microscope de manière à ce que l’objectif soit directement à 8 millimètres au-dessus du DRG lorsqu’il est abaissé. Insérez le thermomètre rectal. Connectez les lignes électriques au coussin chauffant du thermomètre rectal. Connectez le cône de nez aux conduites de gaz isoflurane.

Utilisez un microscope confocal droit avec un objectif DIC 10x/0,4 et le logiciel associé pour l’imagerie. Utilisez les paramètres de filtre vert FITC d’excitation à 495 nanomètres, d’émission à 519 nanomètres et de longueur d’onde de détection entre 500 et 580 nanomètres. Au microscope, trouvez la surface du DRG. Ajustez les pinces sur la platine de manière à ce que la surface DRG soit aussi plane que possible et que la surface maximale soit visualisée dans le plan focal.

Surveiller l’animal tout au long de la procédure pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane sans surdosage. Pour charger le protocole de balayage rapide du microscope, utilisez les paramètres typiques de taille de voxel 2,496 x 2,496 par 16 microns, 512 par 512 pixels, 10 coupes optiques z-stack, 1 unité Airy pour 32 micromètres, 1 % de puissance laser de 488 nanomètres et 5 milliwatts, temps de pixel - 1,52 microseconde, temps de ligne - 0,91 milliseconde, temps d’image - 465 millisecondes, vitesse de balayage LSM de 8, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMD - 650 volts et gain numérique de 1.

Effectuez un court balayage de huit cycles de la DRG en cliquant sur Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition. Créez un film en effectuant une projection orthogonale des balayages à raison d’un balayage par image au fil du temps. Vérifiez manuellement la clarté de l’image et les artefacts d’imagerie, tels que les ondes de luminosité traversant le DRG. Ajustez la position de la pince et l’épaisseur de la section optique, puis répétez cette étape jusqu’à ce que vous obteniez un film clair et de haute qualité.

Chargez ensuite le protocole de balayage haute résolution du microscope en utilisant les paramètres typiques de la taille du voxel 1,248 par 1,248 par 14 microns, 1024 par 1024 pixels, six tranches optiques z-stack, 1,2 unité Airy ou 39 micromètres, 5 % de puissance laser de 488 nanomètres et 25 milliwatts, temps de pixel - 2,06 microsecondes, temps de ligne - 4,95 millisecondes, temps d’image 5,06 secondes, vitesse de balayage LSM de 6, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMT à 650 volts et gain numérique de 1.

Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition pour créer une image haute résolution de la DRG. Chargez le protocole de balayage rapide du microscope et enregistrez l’activité spontanée dans le DRG pendant 80 cycles. Générez un film de projection orthogonale et vérifiez que la qualité de l’image est suffisante pour l’analyse. Pour appliquer des stimuli, réglez le microscope pour effectuer 15 à 20 balayages. Attendez que les balayages 1 à 5 soient terminés pour produire la référence. Appliquez le stimulus pendant les balayages 6 à 10. Attendez au moins cinq minutes après chaque stimulus avant d’appliquer le suivant pour éviter la désensibilisation.

Pour une presse mécanique, tenez la pince algomètre avec la patte entre les palettes sans toucher la patte. Pincez la patte en commençant immédiatement après la fin du balayage 5 et en arrêtant immédiatement après le balayage 10. Surveillez la force de pression à l’aide d’un algomètre et assurez-vous qu’elle ne dépasse pas 10 g au-dessus de la force souhaitée.

Pour les stimuli thermiques, chauffez un bécher d’eau juste au-dessus de la température souhaitée. Lorsque l’eau est à la bonne température, appliquez le stimulus immédiatement après le balayage 5 en immergeant le bassin dans l’eau. Retirez le bécher immédiatement après le balayage 10.