Imagerie de motoneurones marqués par fluorescence dans une jambe de drosophile adulte

Commencez par une configuration de microscope confocal contenant une patte de drosophile fixe, génétiquement modifiée, montée dans l’espace entre deux lamelles. Les axones des motoneurones de la jambe expriment une protéine fluorescente marquée à la membrane.

Utilisez un seul laser et deux détecteurs pour capturer les signaux fluorescents des axones des motoneurones et l’autofluorescence de fond de la cuticule, qui est la couche la plus externe de la jambe.

Ajustez les paramètres d’imagerie pour une résolution et une qualité d’image optimales.

Ajustez la luminosité pour assurer un signal axonal brillant et une autofluorescence saturée de la cuticule.

Capturez une image avec à la fois le signal axonal et l’autofluorescence de la cuticule.

À l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié, ouvrez l’image capturée.

Divisez les canaux et soustrayez l’autofluorescence de la cuticule d’arrière-plan du signal axonal.

Ajustez la luminosité et le contraste des deux signaux pour améliorer la clarté de l’image.

Fusionnez les canaux pour générer une image fusionnée afin de visualiser les axones des motoneurones dans le segment de jambe.

Pour imager les pattes, utilisez le laser de 488 nanomètres et deux détecteurs simultanément pour configurer la première piste afin d’obtenir à la fois la GFP et l’autofluorescence de la cuticule. Sélectionnez un objectif à immersion dans l’huile de 20 à 25x et réglez la résolution sur 1024 x 1024 pixels, avec une profondeur de 12 bits. Et réglez l’espacement z sur 1 micromètre. Chargez la lame sur la platine du microscope.

Et en utilisant la même puissance laser pour les deux détecteurs, ajustez le gain du premier détecteur pour obtenir un signal GFP brillant. Et ajustez le deuxième détecteur pour vous assurer que certaines zones avec un signal de cuticule élevé produisent un signal saturé dans ce détecteur. Ensuite, imagez les jambes, à l’aide des options de mosaïque ou de position pour capturer la jambe entière, si une jambe est étendue ou trop grande pour être imagée dans une seule image.

Pour le traitement d’images, ouvrez la pile confocale dans ImageJ Fiji. Et utilisez le plugin de formats pour ouvrir toutes les images qui ne sont pas au format TIFF. Pour diviser les couches, sélectionnez Image, Couleur et Fractionner les couches. Pour soustraire le signal cuticulaire du signal GFP, ouvrez le Calculateur de processus et d’image, puis sélectionnez la pile du détecteur un comme Image1.

Dans la fenêtre de fonctionnement, sélectionnez Soustraire, puis sélectionnez la piste du Détecteur 2 en tant qu’Image2, de sorte que seul le signal GFP endogène soit obtenu. Utilisez Image, Stacks, Z Protect pour générer une projection d’intensité maximale pour le signal GFP endogène. Utilisez les commandes de la fenêtre de contrôle de la luminosité pour régler la luminosité et le contraste.