En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

L’objectif global de cette procédure est d’inhiber ou de réduire l’expression d’une protéine spécifique dans la rétine du poisson zèbre adulte. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enlever la cornée externe de l’œil de poisson. Ensuite, un petit trou est créé dans la cornée interne de l’œil.

Ensuite, le morpho spécifique du gène est injecté dans le vitré. Enfin, le morpho est électroporé dans les cellules rétiniennes. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une réduction de l’expression des protéines cibles par microscopie par immunofluorescence de coupes de tissu rétinien ou par immuno-transfert.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies dégénératives de la rétine telles que la rétinite pigmentaire. En raison du potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents de la prolifération des cellules gliales de Mueller dans la rétine endommagée, nous pourrions trouver des moyens d’induire une réponse similaire dans les dommages à la rétine humaine. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régénération rétinienne dans la rétine du poisson-zèbre adulte, elle peut être légèrement modifiée pour fournir des informations sur d’autres processus de la rétine, tels que le rôle de protéines spécifiques dans la phototransduction ou le traitement visuel.

Démonstration de la procédure qui a été développée par le Dr Ryan Tummel alors qu’il était post-doctorant. Dans mon laboratoire, il y aura le Dr Travis Bailey, un postdoctorant actuel dans mon laboratoire. Avant de travailler avec des poissons, préparez des morphos marqués à la lissamine chargés positivement qui peuvent être électroporés en cellules en diluant 300 NMO de Morpho dans 100 microlitres d’eau sans nucléases sarcelle dans une solution de trois millimolaires.

Pour enlever la couche cornée externe, anesthésez un poisson zèbre de six à 12 mois dans un milligramme par millilitre de trica ou deux feth d’éthanol dans l’eau de l’aquarium de poisson zèbre enveloppez le poisson zèbre dans un morceau de serviette en papier humidifié couvrant les branchies, mais laissant l’œil exposé. Placez le poisson enveloppé sous un stéréoscope et augmentez le grossissement jusqu’à ce que le diamètre de l’œil remplisse environ un tiers du champ visuel. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler Dumont numéro cinq, saisissez la cornée externe près de la fissure optique à l’endroit d’une légère saillie ou d’une lèvre pour empêcher l’œil de se déloger.

Lorsque vous retirez la cornée, stabilisez-la avec une autre pince à épiler. Ensuite, tirez à un angle bas sur l’œil pour retirer la cornée. Immédiatement après l’ablation de la cornée externe, utilisez un scalpel à lame de saphir pour faire une petite incision dans la cornée à l’endroit où la pupille rencontre la charge de l’iris.

Pointez cinq microlitres de la solution morpho dans une seringue Hamilton équipée d’une aiguille émoussée amovible de calibre 33. Faites-le monter et descendre pour l’éliminer de l’airable dans la conduite. Insérez soigneusement l’aiguille dans le vitré par l’incision.

N’insérez pas l’aiguille trop loin pour éviter de percer la rétine ou de déplacer le cristallin. Injectez lentement la solution morpho dans l’espace du vitriol. Le vitré incolore s’échappera de l’incision lorsqu’il sera déplacé par la solution morpho

Injectez jusqu’à ce qu’une petite quantité de morpho s’échappe de l’incision. Le morino marqué à la lissamine doit être clairement visible à l’intérieur de l’œil. Après l’injection, retournez le poisson dans le réservoir pour le récupérer en utilisant l’autre œil comme contrôle non injecté, réglez les paramètres d’électroporation sur deux impulsions consécutives de 50 millisecondes à 75 volts.

Avec une pause d’une seconde entre les impulsions après l’injection d’environ 10 poissons. Anesthésie à nouveau un poisson injecté et enveloppe-le dans un morceau de papier humidifié. Serviette couvrant juste les branchies, mais laissant l’œil exposé.

Transférez le poisson dans une boîte de Pétri remplie d’anesthésie. Avec les mains gantées, tenez doucement le poisson au fond du plat rempli d’anesthésie, en prenant soin d’immerger complètement l’œil. Pour cibler la rétine dorsale, appuyez doucement sur l’électrode positive vers le bas sur la moitié ventrale de l’œil, ce qui fait pivoter l’œil et exposer la partie dorsale du globe oculaire tout en appuyant sur le côté ventral, placez l’électrode négative à 0,5 à un millimètre de la moitié dorsale exposée de l’œil.

Évitez de placer l’électrode négative directement sur l’œil car cela endommagerait la rétine dorsale. Après avoir déterminé la distance appropriée entre les électrodes, ajustez la vis sur la poignée des électrodes pour maintenir un écartement constant pour l’électroporation ultérieure. Électroporez l’œil et renvoyez le poisson dans un réservoir avec de l’eau fraîche pour le ranimer immédiatement, soumettez le poisson à une procédure qui provoque des changements dans l’expression des gènes rétiniens, tels que la dégénérescence rétinienne induite par la lumière constante.

Lorsque les rétines sont sectionnées du nez au temporal sur l’axe ventral dorsal, les cases bleues ombragées représentent les zones rétiniennes qui sont le plus souvent endommagées par l’événement d’électroporation lui-même. La boîte ombrée en rose représente la zone ciblée pour l’introduction du morpho dans les cellules rétiniennes par électroporation. Comme le montre l’image de droite, trois jours après l’électroporation, l’étiquette de lissamine est toujours visualisée dans toutes les couches et tous les types de cellules d’une rétine sectionnée, y compris les segments externes de la tige, la couche nucléaire externe, la couche interclaire et la couche de cellules ganglionnaires.

L’image vierge de gauche provient de l’œil injecté d’unin, sans aucune morino marquée à la lissamine, l’inactivation complète de la protéine peut être réalisée en trois à cinq jours après l’électroporation en fonction de l’efficacité du morpho. Dans cet exemple, un morpho témoin négatif ou un morpho A-P-C-N-A a été électroporé dans des rétines, et les rétines ont été retirées après une exposition d’un, deux ou trois jours à la lumière, puis le tissu a été traité et immunocoloré avec des anticorps anti PCNA. De nombreuses cellules positives à la PC NA en vert ont été observées dans les trois rétines témoins, mais l’expression de la PCNA était significativement réduite dans les rétines à morphine.

Une fois que vous avez maîtrisé cette technique, vous devriez être en mesure d’effectuer la procédure sur environ 20 poissons en une heure. Lorsque vous essayez d’effectuer cette procédure, il est important de ne pas toucher les électrodes directement à l’œil du poisson après cette procédure. D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie, l’hybridation in situ, la PCR en temps réel et l’immunoblot peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les voies génétiques requises dans la régénération rétinienne.