En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l'expression d'une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excroissance de régénération.

L’objectif global de cette procédure est d’inhiber ou de réduire l’expression d’une protéine spécifique dans la nageoire caudale du poisson zèbre adulte en régénération. Ceci est accompli en amputant d’abord la nageoire caudale et en laissant une petite quantité de tissu se régénérer. Ensuite, la solution morpho est micro-injectée dans chaque blasa sur la moitié de la nageoire.

Le phénotype de morphe est ensuite électroporé dans les cellules de la blase, et l’autre moitié de la nageoire est électroporée à des fins de contrôle. Enfin, l’effet de la réduction de l’expression de la protéine cible sur la croissance régénérative est analysé. En fin de compte, les résultats montrent une inhibition de la régénération tissulaire grâce à l’analyse comparative de la croissance régénérative des moitiés injectées et non injectées de la nageoire.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de la cicatrisation des plaies et à la médecine régénérative en raison du potentiel de découverte de gènes et de voies de signalisation essentiels à la génération de tissus. Pour préparer la fluorescéine marquée morino, diluez 300 nanomoles dans 100 microlitres d’eau sans nucléases. Pour obtenir une solution d’environ trois millimolaires, aliquotez-la dans plusieurs microtubes à centrifuger scellés à la paraffine et conservez-la à température ambiante à l’abri de la lumière. Pour déterminer la concentration exacte de morpho, consultez le protocole écrit pour plus de détails.

Anesthésier le poisson zèbre adulte dans du trica ou deux éthanol phénoxy à raison d’un milligramme par millilitre dans l’eau du réservoir. Lorsque le poisson est complètement anesthésié, placez-le sur le couvercle propre d’une boîte de Pétri et, à l’aide d’un scalpel stérile ou d’une lame de rasoir, amputez la nageoire proximale au premier point de ramification trachéale lipidique, Il est important de couper la nageoire parfaitement perpendiculaire au plan antérieur postérieur de l’animal car les coupes angulaires entraîneront une excroissance inégale de la nageoire des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire. Remettez les poissons dans l’aquarium et maintenez-le à 33 degrés Celsius pour augmenter le taux de régénération en fonction du poids de conception expérimental.

De zéro à deux jours après l’amputation pour la régénération des nageoires. Pour commencer avant d’introduire le morpho, la veille de l’injection de morpho, faites une plaque d’injection avec 2 % d’agarose qui a une encoche découpée à une extrémité du puits, ce qui aidera à stabiliser le poisson pour la procédure d’injection. Juste avant l’injection, diluez le morpho marqué à la fluorescéine et l’eau libre d’ARN et d’ADN à la bonne concentration et incubez dans un bain-marie à 65 degrés Celsius.

Pendant cinq minutes, chargez une aiguille d’injection préalablement préparée et coupez la pointe en biais. Ensuite, anesthésez le poisson et placez-le sur la plaque d’injection. Retirez tout excès de liquide et placez la plaque sur la platine d’un stéréomicroscope.

Orientez l’aiguille juste distale par rapport au rayon osseux. Insérez doucement l’aiguille dans le tissu régénératif juste distal à chaque rayon osseux et poussez distalement jusqu’à ce qu’elle soit située dans le blastème. Lorsque l’aiguille est correctement localisée, suivez les instructions du système de micro-injection et injectez une goutte de cinq nanolitres de morpho par injection.

À chaque injection, une bouffée jaune de solution morpho peut être observée, ce qui aide à localiser l’injection dans le blastème en travaillant dorsalement à partir de la ligne médiane. Injecter environ 75 nanolitres de morpho par rayon osseux sur la face dorsale, en laissant la face ventrale comme contrôle d’électroporation uniquement immédiatement après l’injection du morpho. Retirez la plaque d’injection de l’appareil de micro-injection.

Remplissez bien la plaque d’injection avec la solution d’anesthésie jusqu’à ce que le poisson soit immergé. Pour vous assurer que les électrodes électroporées ne touchent pas le tissu de la nageoire, faites pivoter le poisson sur son côté dorsal et regardez directement le long de la ligne médiane pour l’électroporation. Réglez les paramètres d’électroporation sur 10 impulsions consécutives de 50 millisecondes à 15 volts avec une pause d’une seconde entre les impulsions avec des électrodes de pince à épiler en plaque de platine de trois millimètres de diamètre réglées à proximité mais sans se toucher.

Les nageoires ont électroporé les côtés dorsal et ventral de la nageoire pour empêcher l’accumulation de charge à partir des bulles qui peuvent se former. Essuyez les électrodes avec une lingette kimm humide après chaque électroporation. Enfin, placez le poisson sur une lame de verre ou une boîte de Pétri et imagez rapidement la nageoire, en prenant soin de noter l’orientation ventrale dorsale.

Cette image sera utilisée pour l’analyse de la repousse le lendemain. Remettez le poisson dans l’aquarium si la protéine ciblée est nécessaire à la bonne régénération des nageoires. Une différence spectaculaire entre les moitiés dorsale et ventrale de la nageoire devrait être évidente un jour après l’électroporation ou trois jours après l’amputation.

Prenez une autre photo de l’aileron et associez cette image à une image correspondante prise deux jours après l’amputation après l’électroporation. À l’aide de l’image NIH, tracez les zones deux jours après l’amputation et les trois jours après l’amputation des moitiés dorsale et ventrale. Pour déterminer le pourcentage de surface de croissance des nageoires dorsale par rapport à la surface ventrale, utilisez la formule suivante.

La quantité dorsale trois jours après l’amputation moins deux jours d’amputation dorsale divisée par la quantité ventrale trois jours après l’amputation moins ventrale deux jours après l’amputation multipliée par 100 équivaut à un pourcentage de surface. Lors du test de croissance de la nageoire trois jours après l’amputation ou 24 heures après l’électroporation, le morino marqué à la fluorescéine doit être présent dans la moitié dorsale de la nageoire. Il est normal d’en voir descendre jusqu’au niveau de l’amputation.

Lorsqu’un morpho témoin est injecté dans la moitié dorsale de la nageoire 24 heures après l’électroporation, une excroissance égale à celle de la face ventrale est observée, comme indiqué ici. L’injection de la moitié dorsale de la nageoire avec un morpho expérimental inhibe la repousse de ce côté. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’immunohistochimie et l’hybridation C-deux, la PCR en temps réel et l’immuno-blottage, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les voies génétiques nécessaires à la régénération.