L'utilisation de modèle animal de sepsis pour évaluer de nouvelles thérapies à base de plantes

Sepsis se réfère à un syndrome de réponse inflammatoire systémique résultant d'une infection microbienne, et peut être simulé par une technique chirurgicale appelée ligature du caecum et à la perforation (CLP). Nous décrivons ici une méthode pour utiliser un modèle animal CLP-induite pour cribler des herbes médicinales pour les agents thérapeutiques.

L’objectif global de cette procédure est de produire un modèle murin de septicémie par une procédure chirurgicale appelée SQL Ligation and Puncture, ou CLP. Ceci est accompli en faisant d’abord une incision médiane de 1,5 à deux centimètres sur l’abdomen d’une souris. Ensuite, le sécum est exposé et ligaturé, puis le séum est perforé pour induire une translocation bactérienne.

Enfin, l’incision est fermée. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une augmentation des niveaux de cytokines systémiques et péritonéales ainsi que des symptômes tels que la léthargie et la létalité. Ce que je vais vous montrer, c’est de produire un modèle de sepsis chez la souris appelé sation et ponction, qui est modifié à partir du modèle original développé par le Dr Chandry et ses collaborateurs.

Le principal avantage de ce modèle est qu’il s’agit du modèle de septicémie le plus pertinent. De plus, il est simple, bien caractérisé et économiquement réalisable, et a donc été largement utilisé dans le domaine de la recherche sur le sepsis et l’inflammation. À titre d’exemple, nous démontrerons l’utilisation de ce modèle pour évaluer le potentiel thérapeutique de l’extrait de plantes dans le sepsis.

Pour préparer l’extrait de plantes, faites tremper 10 grammes d’herbes dans 200 millilitres d’eau à 85 degrés Celsius pendant une à quatre heures pour éliminer les particules insolubles, centrifugez la fraction d’eau à 3, 300 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,2 micron. Ensuite, concentrez davantage le filtrat à l’aide d’un filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10 000 kilodaltons et en tournant à 5 000 g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.

À l’aide de cultures de macrophages, des fractions de faible et de haut poids moléculaire ont été examinées pour détecter les activités inhibitrices des médiateurs pro-inflammatoires tardifs, tels que le groupe de mobilité élevée box one ou le HGB one. Pour commencer l’isolement des macrophages en premier, interpéritonéale a administré deux millilitres d’un bouillon de glycol à 4 % TH à des souris normales après trois jours de récolte d’une culture primaire de macrophages péritonéaux, les macrophages dans le DMEM complétés par 10 % de FBS, deux millimolaires de glutamine et 1 % de pénicilline. La streptomycine lave doucement les macrophages adhérents avec optimum et les incube dans le même milieu pendant deux heures.

Ensuite, stimulez-les avec l’endotoxine bactérienne lipopolysaccharide ou LPS 16 heures après la stimulation. Prélevez le milieu conditionné à la cellule et utilisez-le pour effectuer le western blot. Pour mesurer les niveaux de HM GB one.

Quantifiez l’intensité de la bande à l’aide d’une courbe standard générée avec du H mgb un purifié pour établir le sepsis après anesthésie d’une souris avec une injection intramusculaire de 75 milligrammes par kilogramme de kétamine et de 20 milligrammes par kilogramme de xylazine. Et en utilisant un pincement d’orteil pour vérifier son niveau de sédation. Placez la souris en position couchée, nettoyez l’abdomen, puis faites une incision médiane de 15 millimètres pour exposer le caïcum à environ cinq millimètres de la pointe de la suite avec une suture en soie quatre oh.

Lister le caecum puis, à l’aide d’une aiguille de calibre 22, percer une fois le moignon ligaturé pour permettre l’extrusion des selles, ramener immédiatement le caecum dans sa position intra-abdominale normale et fermer l’abdomen. Après que les animaux aient retrouvé conscience et mobilité. Remettez la cage dans la salle animalière après 24 heures.

Après la CLP intrapéritonéale, administrer 200 microlitres d’extrait de plantes ou de contrôle par jour pendant trois jours. Surveiller la survie de l’animal aussi longtemps que nécessaire dans les quelques heures suivant la ligature et la ponction consécutives, ou la chirurgie CLP. Les animaux présentent des signes cliniques de septicémie qui comprennent une piloérection, une léthargie, un regroupement et une diminution de la consommation de nourriture et d’eau.

Les animaux développant une péritonite sévère avec une infection systémique consécutive meurent normalement dans les 48 à 96 heures. Cependant, même les animaux appariés selon l’âge, le sexe et le patrimoine génétique peuvent répondre à la chirurgie de manière distincte au cours d’une septicémie expérimentale, par exemple, 48 heures après la CLP. Alors que certains animaux peuvent s’être approchés de l’état de monticule tel que défini ici, d’autres peuvent rester à un état non moribond.

Des études exhaustives des cytokines circulantes ont révélé des différences spectaculaires dans les niveaux de plusieurs cytokines, y compris IL six, kc, MIP deux et ST nfr, une entre les souris dans les états moribonds et non moribonds. Notamment, ces médiateurs inflammatoires ont été classés comme marqueurs de substitution du sepsis parce que leurs niveaux circulants sont des prédicteurs fiables de l’issue létale dans le sepsis expérimental ou clinique. De plus, la CLP a induit la libération locale de diverses cytokines et chimiokines pro et anti-inflammatoires, par exemple, 48 heures après la CLP, des quantités significatives de la cytokine IL six et des chimiokines KC et MI P deux peuvent encore être mesurées non seulement par voie systémique dans le sang, mais aussi localement dans le liquide de lavage péritonéal.

Ici, les capacités de divers extraits de plantes ou composés de contrôle ont été évaluées pour leur capacité à inhiber la libération de HGB induite par les endotoxines. Ceux qui avaient la capacité d’inhiber la libération de HGB ont été testés in vivo à l’aide d’un modèle murin de septicémie. En raison de la cinétique tardive et prolongée de l’accumulation de HGB one dans le sepsis expérimental, la première dose d’inhibiteurs de HGB one a été administrée 24 heures après le début du sepsis, un moment où les souris ont développé des signes clairs de septicémie, y compris la léthargie, la diarrhée et la piloérection, comme le montre ici, l’administration retardée et répétée d’un composant T vert majeur epi Gallo, La catéchine trois GALLATE ou EGCG à partir de 24 heures après le début de la septicémie a considérablement sauvé les souris de la septicémie mortelle même lorsqu’elle a été administrée par voie orale EGCG a toujours sauvé les souris de la septicémie mortelle, augmentant considérablement les taux de survie des animaux de 16 % à 44 % Une fois maîtrisé, cette ligature et le modèle de ponction peuvent être terminés en moins de cinq minutes si cela est fait correctement.