Name: Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Découvrez la spectroscopie Raman sans contact et sans marquage pour surveiller les cellules et les tissus en temps réel. Cette technique laser permet d'analyser la composition biochimique des échantillons biologiques avec précision.

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Nous tenons à remercier Steffen Koch pour son soutien technique et Shannon Lee Layland (à la fois Fraunhofer IGB Stuttgart) pour ses suggestions utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le programme Attirer de la Fraunhofer-Gesellschaft et le BMBF (à la fois pour KS-L.).

1. Préparation de l&#39;échantillon biologique <ol><li> Préparation de cellules vivantes <ol><li> Préparation de cellules adhérentes <ol><li> Semences dans les cellules in vitro-culture ou fraîchement isolées sur un plat à fond de verre (Greiner BioOne / Allemagne) et les incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que la fixation des cellules est terminée. </li><li> Retirer milieu de culture et laver doucement trois fois avec du PBS mesure préalable. Maintenir les cellules couvertes avec soit PBS ou milieu de culture cellulaire pendant toute la procédure de mesure. </li></ol></li><li> Préparation de cellules en suspension <ol><li> Détachez in vitro des cellules cultivées selon des protocoles communs (par exemple la trypsine-EDTA, raclage cellulaire), centrifuger les cellules et remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans du PBS ou un milieu de culture cellulaire. </li><li> Transférer 100 ul de la suspension cellulaire (concentration: max. 100.000 cellules / ml) à un plat à fond de verre. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de la nattissus ive <ol><li> Après la récolte, les tissus, les transférer à stérile, PBS glacé et de les conserver plus de 12 heures à 4 ° C ou sur la mesure de la glace avant. Des expériences antérieures ont montré qu&#39;une durée de conservation prolongée (temps d&#39;ischémie froide de plus de 12 heures à 4 ° C) a entraîné des modifications spectrales dues à des processus de dégradation naturelle. </li><li> Les mesures doivent être effectuées avec le tissu recouvert de PBS ou moyen pour éviter d&#39;endommager des protéines de la MEC et les cellules en raison de séchage des tissus. </li></ol></li></ol> 2. Raman spectromètre Notre spectromètre Raman personnalisée combine un microscope standard à fluorescence (Olympus IX 71) avec un spectromètre Raman qui permet la comparaison directe des images lumineuses sur le terrain-et la fluorescence avec les spectres Raman. L&#39;ensemble de base se compose d&#39;un laser à 784 nm diode (Toptica photonique AG / Allemagne), un filtre à encoche pour la séparation de la lumière Raman diffusée de-la lumière d&#39;excitation, un microscope unend a. spectrographe (Kaiser Systems Inc optique, Ann Arbor / USA) avec un dispositif à couplage de charge (CCD) optimisé pour la détection de l&#39;information spectrale (F-voir de systèmes d&#39;imagerie soft / Allemagne) 3. Contrôle de la fonction laser <ol><li> Démarrez le logiciel Andor Solis (Andor / Royaume-Uni) et régler la température de la caméra CCD à -60 ° C afin de minimiser le bruit causé par les courants induits thermiquement dans la caméra. </li><li> Placer une plaquette de silicium sur la platine du microscope pour la procédure d&#39;étalonnage. </li><li> Allumez le laser et régler la puissance de 85 mW. </li><li> Utilisez la Cellule logiciel B (Olympus / Allemagne) pour focaliser le laser sur la plaquette jusqu&#39;à ce XY apparaît. </li><li> Mesurer la plaquette de silicium avec un temps d&#39;intégration unique de 1 sec à l&#39;aide d&#39;un objectif 60x air. </li><li> Changer l&#39;unité de l&#39;axe des x de nombre de pixels à décalage Raman (cm -1) dans le logiciel Andor Solis. </li><li> Variez la focalisation du laser du pic de silicium à 520 cm -1 dansl&#39;collectées spectre afin de trouver l&#39;intensité maximale possible pour cette bande Raman. Le montant minimum de chefs d&#39;accusation doit être supérieure à 11.000 à avoir un calibrage réussi. </li></ol> 4. Raman des mesures spectroscopiques Toutes les mesures sont réalisées à température ambiante. <ol><li> Les réglages de base <ol><li> Utilisez un objectif 60x de l&#39;eau d&#39;immersion (Olympus / Allemagne) avec une ouverture numérique de 1,2 pour recueillir le spectre des échantillons. </li><li> Modifiez les paramètres d&#39;acquisition de 10 intégrations / 10 secondes pour un total de 100 secondes par des mesures. </li></ol></li><li> Mesure de cellules adhérentes <ol><li> Sortez le plat à fond de verre avec les cellules et le placer sur la platine du microscope. </li><li> Afin d&#39;obtenir un meilleur signal et garantir la reproductibilité, le laser se concentrer sur le noyau de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre. </li><li> Mesurer un spectre de référence de l&#39;e fond10 spectres très en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Il est important de considérer que lorsque vous changez le focus un nouveau fond doivent être collectées pour chaque profondeur de champ. </li></ol></li><li> Mesure des cellules en suspension <ol><li> Transférer 100 ul de la suspension cellulaire dans le plat à fond de verre et le placer sur la platine du microscope. </li><li> La mise au laser sur le centre de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre. </li><li> Mesurer un spectre de référence de l&#39;arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation. </li></ol></li><li> Mesure des tissus indigènes <ol><li> Prenez l&#39;échantillon et le placer dans un plat à fond de verre. La région d&#39;intérêt (ROI) devrait être orientée vers le bas de la parabole. </li><li> Remplissez le plat avec suffisamment de PBS pour couvrir l&#39;échantillon. </li><li> Placez un couvercle en verre sur l&#39;échantillon afin d&#39;éviter toute movement de l&#39;échantillon pendant les mesures. </li><li> Définir la focalisation du laser dans la structure d&#39;intérêt (résolution en profondeur est laser et le tissu-dépendant) et commencer à recueillir les spectres. </li><li> Collecter un spectre de référence de l&#39;arrière-plan à chaque spectres 10 en déplaçant le laser focaliser sur la zone de tissu ensemble. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation. </li></ol></li><li> Mesure de l&#39;immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections <ol><li> Section frais, des échantillons de tissus composant logiciel enfichable congelés en utilisant une norme cryotom et les monter sur des lunettes de couverture de silice revêtues. </li><li> Colorer les cryocoupes suivant un protocole de routine pour SI, employant seulement une étape de fixation court (max. 10 minutes avec le paraformaldéhyde 4%) et en utilisant des anticorps appropriés pour la détection de la protéine d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer des mesures Raman se concentrant dans la région où se produit la fluorescence. </li></ol></li><li> Expériences dégradation de l&#39;élastine <ol><li> PlaCE l&#39;ventricularis des feuillets porcine disséqués valve aortique (élastine-riche, le sang d&#39;entrée du côté de la couche de valve de valvule cardiaque) faisant face au fond de la cuvette fond de verre. </li><li> Mesurer le tissu natif comme un «non incubé de contrôle» à 30 points aléatoires à travers toute la surface du tissu se concentrant dans les structures fibrillaires. </li><li> Diviser l&#39;échantillon en 3 sections et les placer dans des tubes Eppendorf 2,5 distincts ml remplie avec 2 ml d&#39;une solution d&#39;élastase (5 U / ml, Worthington / Allemagne). </li><li> Incuber le tissu pour 15 ou 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Après une incubation de 15 ou 30 minutes, retirer les tissus du tube Eppendorf et laver soigneusement avec du PBS pour arrêter complètement la réaction enzymatique. </li><li> Mesurer chaque échantillon à 30 points aléatoires, en se concentrant dans les structures fibrillaires. </li></ol></li></ol> 5. Traitement et analyse des données <ol><li> Le traitement des spectres Raman Le pré-traitement de l&#39;spectres générés a été réalisée en utilisant le logiciel OPUS (Bruker Optik GmbH / Allemagne). <ol><li> Afin de réduire les signaux parasites du verre et moyennes ainsi que pour éviter des variations provoquées par les changements de l&#39;orientation au cours de mesures, soustraire le spectre de bruit de fond correspondant à partir des spectres recueillis. </li><li> Réduire les spectres de la région entre les nombres d&#39;onde 400-1800 cm -1, ce qui offre la plus grande quantité d&#39;informations. </li><li> Si nécessaire, normaliser le spectre du pic maximum. Facteurs de normalisation sur les fluctuations d&#39;intensité et les échecs systématiques, ce qui simplifie la détection des changements structurels dans les spectres de l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une correction de base pour accroître la comparabilité entre les différentes expériences. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des spectres Raman Les spectres Raman ont été analysées à l&#39;aide APC avec The Unscrambler (CAMO / Norvège) du logiciel. Cette analyse multivariée détecte les différences et les similitudes au sein des données spectralesensembles. Chaque spectre est tracé comme un seul point dans un espace multidimensionnel basé sur les chiffres recueillis pour chaque quart de travail Raman. Chaque composante principale (PC) décrit une certaine quantité de l&#39;information totale contenue dans les données originales. Le premier PC est celui qui contient la plus grande source de variation. Chaque PC contient ce qui suit, dans l&#39;ordre, moins d&#39;informations que la précédente. Chaque variable a un score et un chargement sur chaque PC. En traçant PC (= scores), les corrélations d&#39;échantillon importantes peuvent être exposés. Les charges de décrire la contribution de chaque variable analysée à l&#39;APC. <ol><li> Étiquetez chaque groupe de mesures par la création de gammes de ligne pour chaque groupe d&#39;échantillons. </li><li> Utilisez les réglages de base suivants pour l&#39;APC: ski de validation, l&#39;algorithme NIPALS, pas de rotation et de commencer l&#39;analyse. Ces paramètres sont des spectres dépend. </li><li> Effectuez l&#39;APC. </li></ol></li></ol> 6. Les résultats représentatifs Raman spECTRA générée à partir de cellules adhérentes révèlent souvent un faible rapport signal-sur-bruit et un signal de faible intensité globale (Fig. 1) 11. En raison du fait que la focalisation du laser doit être situé à proximité du fond de verre, l&#39;influence de l&#39;interférence signal de verre est assez élevé, ce qui provoque de masquage du signal réelle de l&#39;échantillon. Par conséquent, le signal de l&#39;échantillon peut être réduite ou même éliminée au cours d&#39;une arrière-plan après la soustraction. Ainsi, nous préférons utiliser des cellules en suspension pour notre analyse spectroscopique Raman, car ils permettent la détection de plus amples renseignements spectrale détaillée. Cependant, les spectres de cellules adhérentes et la suspension présentent les mêmes pics principaux ne diffèrent que par leurs intensités. Pour la caractérisation des différents types de cellules au sein d&#39;une suspension, pas de pré-traitement est nécessaire. Les spectres Raman moyenne et les écarts types de fibroblastes humains, les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les chondrocytes et les kératinocytes mesurée en suspension sontreprésentée sur la figure 2. Tous les spectres Raman ont une structure similaire, avec des pics provenant de biomolécules typiques tels que les protéines, les acides nucléiques et des lipides (voir tableau 1). 12 Pour ces types de cellules, la région spectrale entre 600 et 1800 cm -1 contient la plus pertinente l&#39;information spectrale, par où les différences claires entre les sont détectables différents types de cellules (Fig. 2A). Exemplaire, nous avons souligné une région spectrale (1280-1350 cm -1) affichant de nettes différences structurelles, ce qui n&#39;est plus assignable à des vibrations moléculaires de collagène et des lipides. En revanche, les analyses morphologiques ne sont pas adaptés pour l&#39;identification et la distinction de la plupart des cellules (Fig. 2B-I). Bien que la différence entre les chondrocytes et les cellules de la peau est observable (Fig. 2D, H par rapport à B, F et E, I), les fibroblastes et les MSC sont difficiles à séparer en utilisant uniquement champ lumineux micrsocopier (Fig. 2B, F par rapport à C, G) 13. Raman analyse spectroscopique de tissu natif, en particulier des protéines ECM, exige que le retour sur investissement peut être visualisée par imagerie à champ clair afin d&#39;être en mesure de se concentrer sur la structure respective. Pour l&#39;attribution d&#39;une protéine à un large empreinte spécifique, nous avons généré des spectres Raman disponibles dans le commerce des protéines pures et cryosections immunohistologically colorées. Ici, nous avons identifié les spectres d&#39;empreintes digitales des fibres élastiques dans les tissus natifs comparant élastine lyophilisée et immunofluorescence tachés de cryosections employant un anticorps dirigé contre l&#39;élastine. Cependant, depuis l&#39;élastine dispose d&#39;un autofluorescence élevée, ce qui se reflète dans les spectres Raman, l&#39;analyse des données est difficile (figure 3A). Afin de réduire l&#39;échec systématique due à l&#39;échantillon des propriétés spécifiques telles que l&#39;autofluorescence, un traitement approprié des ensembles de données est cruciale. Dans nos données, unealyses, nous avons utilisé la normalisation afin d&#39;éliminer l&#39;intensité du signal significativement plus élevé de la protéine pure élastine, et donc, nous étions en mesure de générer comparables spectres Raman (Fig. 3B). L&#39;élastine est une des protéines de la MEC les plus stables dans le corps et est donc très difficile à se dégrader. 14 Dans notre dispositif expérimental, nous avons provoqué la dégradation de l&#39;élastine dans les tracts porcine sains de la valve aortique en effectuant une digestion enzymatique. L&#39;application de l&#39;analyse multivariée PCA, nous avons identifié des différences significatives entre les spectres Raman de enzymatiquement échantillons traités et les contrôles natifs (figure 3C). Ces différences spectrales ont été observées dans le spectre de chargement à 861, 1003 et 1664 cm -1. Attendus des changements structurels dans les fibres d&#39;élastine contenant dus aux délais de exposition prolongée à l&#39;élastase ont été présentés par coloration HART (fig. 4), qui ont également été traduit dans plus de groupes distincts marquer séparables (Fig. 3C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figure 1. Moyenne des spectres Raman des fibroblastes détachées et adhérente. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figure 2. (A) moyenne des spectres Raman et écarts-types des quatre différents types de cellules primaires isolées (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes). La trame met en évidence la région spectrale de 1280 - 1350 cm -1 avec des différences de structure. (BE) Bright images en champ de détachés (B) des fibroblastes, (C) MSCS, (D) et les chondrocytes (E) kératinocytes. La barre d&#39;échelle est égal à 20 um. (FI) à champ clair des images de adhérentes (F), des fibroblastes (G) MSCS, (H) et les chondrocytes (I) kératinocytes. La barre d&#39;échelle est égal à 200 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figure 3. (A) des spectres Raman sans normalisation des lyophilized élastine (ligne bleue), immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections (ligne orange) et des fibres élastiques (ligne rouge) mesurées dans les natifs des tracts de la valve aortique. L&#39;intensité du signal élevé de l&#39;élastine lyophilisée est causée par autofluorescence. (B) des spectres Raman après la normalisation en vue d&#39;éliminer les défaillances systémiques. (C) Les scores et les charges de la comparaison entre la non-traitée de contrôle (rouge) et enzymatiquement dégradé (bleu et vert) fibres élastiques au sein du tissu natif. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figure 4. HART&#39;s tachés tracts porcine valve aortique. Les fibres élastiques sont visualisées en noir. (A) et (B) démontrer la non-traité le contrôle et (C) et (D) représentent des échantillons de tissus qui ont été exposés à l&#39;élastase enzyme dégradant pour l&#39;élastine-30 minutes. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre d&#39;onde en cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Affectation 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Les phospholipides </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> ADN / ARN de bases, Épine dorsale OPO </td><td> ADN / ARN </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Phénylalanine </td><td> Protéine </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amide III </td><td> Protéine </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Protéine / lipide </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amide IC = C </td><td> Des lipides Protéines </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Bandes Raman qui sont détectés dans les spectres de tous les types de cellules (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes).

<ol><li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li>
<li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li>
<li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Med.+Devices%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues%3A+implications+for+long-term+graft+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12(1928).</li>
<li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+scattering+of+collagen%2C+gelatin%2C+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li>
<li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li>
<li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li>
<li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Spectroscopy%3A+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+elastic+tissue+biology%3A+elastin+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li>
<li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La spectroscopie Raman est un outil approprié pour analyser les échantillons biologiques, tels que in vitro des cultures de cellules et des protéines ECM ainsi que les cellules dans les tissus natifs. 11,15,16 Ici, nous avons démontré que ce contact non, sans étiquette technique permet la la discrimination des différents types de cellules et la détection de la dégradation des protéines ECM fondée uniquement sur la composition biomoléculaire intrinsèque de ces échantillons biologiques. Le principal avantage de la spectroscopie Raman est la capacité à quantifier de manière non invasive l&#39;empreinte biochimique d&#39;un échantillon par son spectres Raman qui en résulte. Contrairement à la spectroscopie infrarouge, ce qui donne des informations similaires, les spectres Raman peuvent être recueillies à partir d&#39;échantillons aqueux, comme la dispersion Raman de l&#39;eau est faible. En outre, la spectroscopie Raman est uniquement sur la base de la détection de la rétrodiffusion de la lumière monochromatique, par conséquent, aucun traitement d&#39;échantillonnage est nécessaire de mesure précédent. Ces attributs font de Raspectroscopie homme une alternative prometteuse pour le potentiel dans les applications d&#39;imagerie in vivo. À ce sujet, anti-Stokes cohérente spectroscopie Raman (CARS) est une technique très intéressante car elle permet d&#39;accélérer et d&#39;acquisition plus sensible des données basées sur les mêmes signaux vibratoires utilisés dans nos expériences. 15,16 D&#39;autres méthodes alternatives, y compris multiphotonique induite par autofluorescence et imagerie de seconde génération d&#39;harmoniques ont déjà été avérée appropriée pour le suivi des échantillons biologiques non invasive ou minime 17. Cependant, ces modalités d&#39;imagerie sont associés à des coûts très élevés et sont limités à autofluorescence génératrices de molécules. En outre, spectromètre Raman est facile à combiner avec microscopes optiques conventionnels. Ces caractéristiques font de la spectroscopie Raman un outil précieux pour étudier des échantillons biologiques dans les environnements physiologiques. Une des limites actuelles de notre spectroscopie Raman est mis en placela mise au point laser relativement petite (250 nm au maximum à moitié pleine largeur (FWHM) latérale et 700 nm FWHM axiale) qui est créé par un objectif à grande ouverture numérique (NA = 1,2). Même si une grande ouverture numérique permet de couvrir une bonne quantité de la lumière émise Raman cédant dans un fort rapport signal sur bruit, la haute NA ne produit qu&#39;une petite collection accent sein de l&#39;échantillon qui est généralement beaucoup plus petite qu&#39;une cellule. Afin de comparer les spectres Raman de différentes cellules, la collection d&#39;un éventail représentatif est essentiel, qui est difficile à obtenir avec une zone de petit foyer. Pour résoudre ce problème, nous travaillons sur un processus visant à automatiser la collecte de signal à différents points de la cellule (= cartographie spectroscopique Raman), résultant en une moyenne spectrale et se livrant à un éventail représentatif. En outre, cette technique vous donnera un aperçu de la répartition des bandes Raman spécifiques, par exemple de la distribution des protéines dans une cellule. Bioléchantillons LOGIQUE sont très complexes et se composent d&#39;un mélange hétérogène de biomolécules qui contribuent à la spectres Raman recueillis. Par conséquent, le motif spectrale est grande complexité et la surveillance d&#39;un type unique d&#39;une molécule dans un spectre Raman est difficile à atteindre avec le chevauchement de signaux différents molécule. En outre, la fluorescence intrinsèque de l&#39;échantillon peut masquer des informations précieuses sur les plus faibles signaux Raman. Fait intéressant, dans certains de nos études précédentes, nous avons identifié autofluorescence dans les spectres Raman comme le principal facteur de différenciation entre les types cellulaires (cellules souches mésenchymateuses et les fibroblastes) en utilisant un outil d&#39;analyse appropriée 13. Nous avons également identifié que les changements dans l&#39;intensité du signal Raman globale peut servir un indicateur de l&#39;état de collagène et des fibres de collagène au sein de l&#39;ECM de tracts de la valve aortique. 9 Toutefois, lorsque l&#39;on analyse l&#39;état de l&#39;élastine dans ces tissus, nous n&#39;étions pas en mesure de détecter des résultats similaires. Comme mentionné dans le résultatla section s, nous étions seulement capables de détecter des altérations de bandes spécifiques Raman dans les échantillons traités par l&#39;élastase par rapport aux contrôles natifs. Nous n&#39;avons pas vu une diminution du signal global Raman dans les échantillons traités par voie enzymatique comme prévu. Ces observations entraîné dans un complot score qui n&#39;a pas révélé de la formation de grappes clair comme on le voit dans l&#39;étude précédente. 9 En revanche, l&#39;influence du traitement enzymatique est détectable dans les résultats de l&#39;ACP. Nous supposons que ces divergences entre les deux protéines de la MEC, l&#39;élastine et le collagène, sont basées sur les différences morphologiques et différents processus de dégradation enzymatiques: dans le dépliant de la valve aortique, la zone riche en collagène (fibreuse) est une couche continue qui devient desserré en raison de la traitement enzymatique, grâce à quoi l&#39;élastine contenant la zone (ventricularis) présente une configuration de réseau qui apparaît après une exposition à une fragmentation de l&#39;élastase (fig. 4). Des mesures ponctuelles simples ne sont donc pas appromangé à détecter de telles ruptures de petits au sein du réseau d&#39;élastine. Ici, une cartographie Raman du tissu aiderait à identifier les pannes de réseau. Un autre défi en spectroscopie Raman d&#39;échantillons biologiques est de réduire les temps de mesure. Une solution consiste à augmenter la puissance du laser, qui est adapté aussi longtemps que les échantillons biologiques ne sont pas affectés par la photo-dommages. Toutes nos expériences actuelles sont la preuve de principe des études portant sur ​​la recherche fondamentale, mais notre objectif global est de mettre en œuvre la spectroscopie Raman pour des applications cliniques, y compris la médecine régénérative (contrôle de la qualité par exemple de l&#39;ingénierie tissulaire produits), suivi du greffon pré-transplantation et le diagnostic du cancer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> élastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-élastine </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampon citrate </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> plats à fond de verre </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> The Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie raman

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Technologies non-destructive, sans contact et sans étiquette pour surveiller cultures cellulaires et tissulaires sont nécessaires dans le domaine de la recherche biomédicale. 1-5 méthodes de routine Cependant, actuellement disponibles nécessitent des étapes de traitement et de modifier l&#39;intégrité des échantillons. Spectroscopie Raman est un procédé rapide qui permet la mesure d&#39;échantillons biologiques, sans la nécessité d&#39;autres étapes de traitement. . Cette technologie à base de laser détecte la diffusion inélastique d&#39;une lumière monochromatique 6 tant chaque vibration chimique est affecté à une bande de fréquences spécifique Raman (nombre d&#39;onde en cm -1), chaque échantillon biologique comprend un motif typique spectrale en raison de leur composition biochimique inhérente 7. - 9 Dans les spectres Raman, les intensités des pics en corrélation avec le montant des obligations actuelles moléculaires. 1 Similitudes et différences des ensembles de données spectrales peuvent être détectés en utilisant une analyse multivariée (par exemple l&#39;analyse en composantes principales (ACP)) 10. </sup&gt; Ici, nous effectuons la spectroscopie Raman de cellules vivantes et de tissus natifs. Les cellules sont ensemencées sur des boîtes soit à fond de verre ou maintenues en suspension dans des conditions normales de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2) avant la mesure. Tissus autochtones sont disséqués et conservés dans un tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C des mesures préalables. En fonction de notre dispositif expérimental, nous avons alors soit porté sur le noyau de la cellule ou de la matrice extracellulaire (ECM) des protéines telles que l&#39;élastine et du collagène. Pour toutes les études, un minimum de 30 cellules ou 30 points aléatoires d&#39;intérêt au sein de l&#39;ECM sont mesurés. De données des étapes de traitement de soustraction du fond incluses et la normalisation.

La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l&#39;ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Des technologies non destructives, sans contact et sans marquage pour le suivi des cultures cellulaires et tissulaires sont nécessaires dans le domaine de la recherche biomédicale.1-5 Cependant, ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les cellules et les tissus au moyen d'une méthode sans contact et sans marqueur. Cela est réalisé grâce à la spectroscopie Raman, une technologie basée sur un laser qui détecte la diffusion inélastique de la lumière monochromatique, produisant un profil spectral typique pour chaque échantillon biologique en fonction de sa composition biochimique intrinsèque, à l'aide d'un microscope à fluorescence standard couplé à un spectromètre Raman. La comparaison directe d'images en champ clair et en fluorescence avec les spectres Raman est utilisée pour surveiller de nombreux échantillons biologiques.Chaque vibration chimique est attribuée à une bande Raman spécifique, et l'intensité du pic est corrélée à la quantité de liaisons moléculaires présentes. Les similitudes et différences entre les ensembles de données spectrales sont détectées. En utilisant une analyse multivariée, les spectres obtenus peuvent être exploités pour vérifier l'intégrité des tissus après prélèvement d'une biopsie ou pour confirmer la stérilité des cellules isolées.En outre, cette technique permet la caractérisation et l'identification de différents types cellulaires in vitro. En fin de compte, la spectroscopie Raman est une technique prometteuse basée sur un laser pour les applications en ingénierie tissulaire et cliniques. Grâce à une analyse sans contact et sans marquage, la procédure sera démontrée par Daniel Cabal Barrio, technicien, et Miriam Tala, étudiante au doctorat, dans mon laboratoire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes courantes existantes, telles que l'histologie et l'imagerie par immunofluorescence, est qu'aucun traitement de l'échantillon n'est requis.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'état des cellules individuelles et les composants de la matrice, elle peut également être appliquée à des tissus et organes multicellulaires. Pour préparer des spectres Raman personnalisés, un microscope à fluorescence standard est couplé à un spectromètre Raman, ce qui permet la comparaison directe d'images de fluorescence avec des spectres Raman. Le dispositif de base comprend un laser à diode de 784 nanomètres, un filtre réjecteur permettant de séparer la lumière Raman diffusée de la lumière d'excitation, un microscope et un spectrographe équipé d'un dispositif à couplage de charge optimisé pour la détection d'informations spectrales.Pour contrôler la fonction du laser, lancez le logiciel solace et réglez la température de la caméra CCD à moins 60 degrés Celsius afin de minimiser le bruit causé par les courants induits thermiquement dans la caméra. Placez une plaquette de silicium sur la platine du microscope pour la procédure d'étalonnage. Allumez le laser et réglez la puissance à 85 milliwatts.Utilisez la cellule logicielle B pour focaliser le laser sur la plaquette jusqu'à l'apparition de XY. Mesurez la plaquette de silicium avec un temps d'intégration unique d'une seconde. À l'aide d'un objectif à air de 60 X, modifiez l'unité de l'axe X du nombre de pixels à ramen.Le décalage dans le logiciel And or Soli permet de modifier la mise au point laser du pic de silicium à un nombre d'onde de 520 dans le spectre recueilli. Afin d'obtenir l'intensité maximale possible pour cette bande Raman, le nombre minimal de comptes doit être supérieur à 11 000 pour qu'une étalonnage réussi puisse être effectué avant la mesure spectrale. Préparez les échantillons biologiques conformément aux instructions du protocole écrit. Toutes les mesures sont effectuées à température ambiante, comme indiqué dans cette vidéo.À l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau 60 x ayant une ouverture numérique de 1,2, les spectres doivent être collectés en utilisant 10 intégrations par 10 secondes, pour un total de 100 secondes par mesure. Pour effectuer la mesure de cellules adhérentes, placez une boîte à fond de verre contenant les cellules sur la platine du microscope. Afin d’obtenir un meilleur signal et garantir la reproductibilité, focalisez le laser sur le noyau cellulaire, éteignez la lumière du microscope, puis commencez à collecter le spectre.Relevez un spectre de référence du fond chaque 10 spectres en déplaçant le point focal du laser à côté de la cellule. Il est important de noter que lors d'un changement de mise au point, un nouveau fond doit être enregistré pour chaque profondeur de mise au point. Alternativement, pour mesurer des cellules en suspension, transférez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans une boîte en verre à fond de verre.Après avoir placé l'échantillon sur la platine du microscope, focalisez le laser au centre de la cellule, éteignez la lumière du microscope, puis recommencez à collecter le spectre. Mesurez un spectre de référence du fond chaque 10&nbsp;spectres en déplaçant le point focal du laser à côté de la cellule. Pour mesurer les spectres de tissus natifs, placez l'échantillon dans une boîte avec fond en verre.La région d'intérêt doit être orientée vers le fond de la boîte. Remplissez la boîte avec suffisamment de PBS pour recouvrir l'échantillon. Placez un couvre-objet sur l'échantillon afin d'éviter tout déplacement.Pendant les mesures, régler le foyer du laser sur la structure d'intérêt et commencer à collecter les spectres. Collecter un spectre de référence du fond toutes les 10 acquisitions en déplaçant le foyer du laser en dehors de toute zone tissulaire, en veillant à toujours obtenir un nouveau fond pour chaque profondeur de foyer lors de la mesure spectrale de coupes cryogéniques marquées par immunofluorescence. Préparer des échantillons de tissu frais congelés par trempe.À l'aide d'un cryostat standard, montez-les sur des lamelles recouvertes de silice. Coloriez les coupes cryogéniques selon un protocole courant d'immunofluorescence, en utilisant uniquement une brève étape de fixation et des anticorps appropriés pour la détection de la protéine d'intérêt. Réalisez des mesures Raman en ciblant la zone où se produit la fluorescence.Pour démontrer les expériences de dégradation de l'élastine, les ventricules des feuillets valvulaires aortiques porcins disséqués sont positionnés face inférieure vers le bas du verre. Plat inférieur. Mesurer le tissu natif comme témoin non incubé en 30 points aléatoires répartis sur toute la surface du tissu.L'observation des structures fibrillaires a permis de diviser l'échantillon en deux sections, puis celles-ci ont été placées dans deux tubes eend distincts de 2,5 millilitres contenant chacun deux millilitres de solution d'élastase. Incuber le tissu pendant 15 ou 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, retirer les tissus du tube einor et les laver soigneusement avec du PBS afin d'arrêter complètement la réaction enzymatique.Mesurez chaque échantillon en 30 points aléatoires en vous concentrant sur les structures fibrillaires. Le traitement des spectres Raman commence par le prétraitement des spectres obtenus à l'aide du logiciel Opus. Tout d'abord, soustrayez le spectre de fond correspondant des spectres collectés afin de réduire les signaux parasites provenant du verre et du milieu, ainsi que d'éviter les variations causées par des changements de mise au point.Pendant les mesures, réduire les spectres à la région du nombre d'onde comprise entre 401 et 800, qui offre la quantité d'information la plus élevée si nécessaire. Normaliser les spectres par normalisation au pic maximal, ce qui compense les fluctuations d'intensité dues aux défaillances systématiques, facilitant ainsi la détection des changements structuraux dans les spectres de l'échantillon. Effectuer une correction du bruit de fond afin d'améliorer la comparabilité entre différentes expériences.Analyser les spectres Raman à l'aide de l'analyse en composantes principales, ou ACP, avec le logiciel Unscrambler. Cette analyse multivariée détecte les différences et les similitudes au sein des ensembles de données spectrales. Chaque spectre est représenté comme un point unique dans un espace multidimensionnel, basé sur les comptages recueillis pour chaque décalage Raman.Chaque composante principale, abrégée en CP, décrit une certaine quantité de l'information totale contenue dans les données initiales. La première CP est celle qui contient la plus grande source de variation. Chaque CP suivante contient, par ordre décroissant, moins d'information que la précédente.Chaque variable possède un score et une contribution (loading) pour chaque composante principale. En traçant les composantes principales, on peut mettre en évidence des corrélations importantes entre échantillons. Les contributions décrivent l'apport de chaque variable analysée à l'ACP. Étiquetez chaque groupe de mesures en créant des plages de lignes pour chaque groupe d'échantillons, puis utilisez les paramètres de base suivants pour la validation croisée de l'ACP : l'algorithme Nip Al, aucune rotation, et lancez l'analyse.Ces paramètres dépendent des spectres. Enfin, effectuez l'ACP sur les spectres Raman bruts générés à partir de cellules adhérentes, qui révèlent souvent un faible rapport signal sur bruit et une faible intensité globale du signal. Le foyer du laser doit être réglé près du fond en verre, ce qui masque le signal réel de l'échantillon.Par conséquent, le signal de l'échantillon pourrait être réduit au minimum, voire éliminé, lors d'une soustraction ultérieure du fond. En revanche, les cellules en suspension permettent la détection d'informations spectrales plus détaillées. Toutefois, les spectres des cellules adhérentes et en suspension présentent les mêmes pics principaux, ne différant que par leurs intensités. Ces entités permettent la caractérisation de différents types cellulaires au sein d'une suspension, sans traitement préalable requis.Les spectres Raman moyens et les écarts types de fibroblastes humains, de cellules souches mésenchymateuses, de chondrocytes et de kératinocytes mesurés en suspension sont représentés ici. Tous les spectres Raman présentent une structure similaire avec des pics provenant de biomolécules typiques telles que les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Pour ces types cellulaires, la région spectrale comprise entre le nombre d'onde 601 et 800 contient les informations spectrales les plus pertinentes permettant de distinguer clairement les différents types cellulaires.Une région spectrale exemplaire présente des différences structurelles nettes, attribuables à des vibrations moléculaires du collagène et des lipides. En revanche, les analyses morphologiques ne conviennent pas à l'identification et à la distinction de la plupart des cellules. Bien que la différence entre les chondrocytes et les cellules cutanées soit observable, il est difficile de distinguer les fibroblastes et les cellules souches mésenchymateuses.En utilisant exclusivement la microscopie en champ clair pour associer un tissu natif à un spectre d'empreinte spécifique, des spectres Raman ont été générés à partir de protéines pures disponibles commercialement et de coupes cryogéniques colorées par immunohistologie. Ici, les spectres d'empreinte des fibres élastiques ont été identifiés dans les tissus natifs en les comparant à des coupes cryogéniques lyophilisées d'élastine et marquées par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'élastine. Toutefois, comme l'élastine présente une forte autofluorescence, qui se reflète dans les spectres Raman, l'analyse des données est complexe, et il est essentiel de réduire les erreurs systématiques dues aux propriétés spécifiques de l'échantillon telles que l'autofluorescence, ainsi qu'un traitement approprié des jeux de données est crucial.Dans l'analyse des données, une normalisation a été utilisée afin d'éliminer l'intensité de signal nettement plus élevée de la protéine d'élastine pure, permettant ainsi d'obtenir des spectres Raman comparables. L'élastine est l'une des protéines de la matrice extracellulaire les plus stables dans l'organisme et est par conséquent très difficile à dégrader. Ici.La dégradation de l&#39;élastine a été induite dans des feuillets valvulaires aortiques porcins sains par une digestion enzymatique ; en appliquant une analyse multivariée, des différences significatives ont été identifiées entre les spectres Raman des échantillons traités enzymatiquement et les témoins natifs. Ces différences spectrales ont été observées dans le spectre de chargement aux nombres d&#39;onde 861, 1003 et 1 664. Les changements structuraux attendus dans les fibres contenant de l&#39;élastine, dus à des durées d&#39;exposition prolongées à l&#39;élastase, se reflètent dans des groupes de scores plus distinctement séparés. Les groupes présentés ici correspondent aux scores de la comparaison entre le témoin non traité et les fibres élastiques dégradées enzymatiquement au sein du tissu natif. Ces changements structuraux attendus sont également visibles sur les feuillets valvulaires aortiques porcins colorés du cœur, comme illustré dans cet encart par la comparaison entre le témoin non traité et les échantillons de tissu exposés à l&#39;enzyme intégrant l&#39;élastine, l&#39;élastase, pendant 30 minutes.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et matricielle, ainsi qu'en médecine régénérative et en ingénierie tissulaire, leur permettant non seulement d'effectuer une analyse en temps réel du phénotype cellulaire, mais aussi d'identifier les interactions cellulaires et cellule-matrice cruciales en Z deux au sein d'un environnement naturel.

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