Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l'ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les cellules et les tissus à l’aide d’une méthode sans contact et sans marqueur. Ceci est réalisé grâce à la spectroscopie ramen, une technologie basée sur le laser qui détecte la diffusion inélastique de la lumière monochromatique, produisant un motif spectral typique pour chaque échantillon biologique en fonction de sa composition biochimique inhérente à l’aide d’un microscope à fluorescence standard couplé à un spectromètre ramen. La comparaison directe d’images en fond clair et en fluorescence avec des ramen Spectra est utilisée pour surveiller de nombreux échantillons biologiques.

Chaque vibration chimique est attribuée à une bande Raman spécifique, et l’intensité maximale est corrélée à la quantité de liaisons moléculaires présentes. Les similitudes et les différences entre les ensembles de données spectrales sont détectées. En utilisant une analyse multivariée, les spectres résultants peuvent être utilisés pour vérifier l’intégrité des tissus après le prélèvement d’une biopsie ou pour prouver la stérilité de cellules isolées.

De plus, cette technique permet de caractériser et d’identifier différents types de cellules in vitro. En fin de compte, la spectroscopie ramen est une technique laser prometteuse pour l’ingénierie tissulaire et les applications cliniques Grâce à une analyse sans marquage sans contact, Daniel Cabal Barrio, technicien, et Miriam Tala, doctorante pour mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de routine existantes, telles que l’histologie et l’imagerie par immunofluorescence, est qu’aucun traitement d’échantillon n’est nécessaire.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’état d’une cellule unique et des composants de la matrice, elle peut également être appliquée aux tissus et organes multicellulaires. Pour préparer des spectres de ramen personnalisés, un microscope à fluorescence standard est couplé à un spectromètre de ramen qui permet de comparer directement les images de fluorescence avec les spectres de ramen. La configuration de base se compose d’un laser à diode de 784 nanomètres, d’un filtre coupe-bande pour la séparation des ramen, de la lumière diffusée à partir de la lumière d’excitation, d’un microscope et d’un spectrographe avec un dispositif à couplage de charge optimisé pour la détection d’informations spectrales.

Pour contrôler le fonctionnement du laser, démarrez le logiciel et/ou résolvez la température de la caméra CCD à moins 60 degrés Celsius pour minimiser le bruit causé par les courants thermiquement induits dans la caméra. Placez une plaquette de silicium sur la platine du microscope pour la procédure d’étalonnage. Allumez le laser et réglez la puissance sur 85 milliwatts.

Utilisez la cellule B du logiciel pour focaliser le laser sur la plaquette jusqu’à ce que XY apparaisse. Mesurez la plaquette de silicium avec un temps d’intégration unique d’une seconde. À l’aide d’un objectif aérien 60X, changez l’unité de l’axe X du nombre de pixels au ramen.

Le décalage dans le logiciel et ou Soli fait varier la focalisation laser du pic de silicium au numéro d’onde 520 dans le spectre collecté. Afin de trouver l’intensité maximale possible pour cette bande de ramen, le nombre minimum de comptages doit être supérieur à 11 000 pour qu’un étalonnage réussi soit réussi avant la mesure spectrale, préparez les échantillons biologiques comme indiqué dans le protocole écrit. Accompagnant cette vidéo, toutes les mesures sont effectuées à température ambiante.

À l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 60x avec une ouverture numérique de 1,2, les spectres doivent être collectés à l’aide de 10 intégrations toutes les 10 secondes, pour un total de 100 secondes par mesure. Pour effectuer la mesure d’une cellule adhérente, placez une boîte à fond de verre maintenant les cellules sur la platine du microscope. Afin d’obtenir un meilleur signal et d’assurer la reproductibilité, concentrez le laser sur le noyau de la cellule, éteignez la lumière du microscope et commencez à collecter le spectre.

Mesurez un spectre de référence de l’arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant le foyer laser à côté de la cellule. Il est important de tenir compte du fait que lors du changement de mise au point, un nouvel arrière-plan doit être collecté pour chaque profondeur de mise au point. Alternativement, afin de mesurer les cellules et la suspension, transférez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans une boîte à fond de verre.

Après l’avoir placé sur la platine du microscope, focalisez le laser sur le centre de la cellule, éteignez la lumière du microscope et recommencez à collecter le spectre. Mesurez un spectre de référence de l’arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant le foyer laser à côté de la cellule. Pour mesurer les spectres des tissus natifs, placez l’échantillon dans une boîte à fond de verre.

La région d’intérêt doit être orientée face au fond du plat. Remplissez le plat avec suffisamment de PBS pour couvrir l’échantillon. Placez un verre de protection sur l’échantillon pour éviter tout mouvement de l’échantillon.

Pendant les mesures, réglez le foyer laser dans la structure d’intérêt et commencez à collecter les spectres. Collectez un spectre de référence de l’arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant le foyer laser hors de toute la zone tissulaire, en collectant toujours un nouvel arrière-plan pour chaque profondeur de foyer pour la mesure spectrale des sections cryogéniques marquées par immunofluorescence. Sectionner des échantillons de tissus congelés fraîchement isolés.

À l’aide d’un cryo-ome standard, montez-les sur des verres de couverture recouverts de silice. Colorer les coupes cryogéniques en suivant un protocole de routine d’immunofluorescence, en utilisant uniquement une courte étape de fixation et en utilisant des anticorps appropriés pour la détection de la protéine d’intérêt effectuée. Les mesures de ramen se concentrent sur la zone où la fluorescence se produit.

Pour démontrer les expériences de dégradation de l’élastine, les ventricules des feuillets de la valve aortique porcine disséqués sont positionnés face au fond du verre. Plat inférieur. Mesurez le tissu natif en tant que témoin non incubé à 30 points aléatoires sur toute la surface du tissu.

La focalisation sur les structures fibrillaires a divisé l’échantillon en deux sections et les a placées dans des tubes séparés de 2,5 millilitres remplis de deux millilitres d’une solution d’élastase. Incuber le tissu pendant 15 ou 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirez les tissus du tube einor et lavez-les soigneusement avec du PBS afin d’arrêter complètement la réaction enzymatique.

Mesurez chaque échantillon à 30 points aléatoires en se concentrant sur les structures fibrillaires. Le traitement des spectres Raman commence par le prétraitement des spectres générés à l’aide du logiciel Opus. Tout d’abord, soustrayez le spectre de fond correspondant des spectres collectés afin de réduire les signaux interférents du verre et du support, ainsi que d’éviter les variations causées par les changements de foyer.

Pendant les mesures, réduisez les spectres à la région du nombre d’ondes entre 401 et 800, qui offre la plus grande quantité d’informations si nécessaire. Normaliser les spectres à la normalisation maximale du pic, prendre en compte les fluctuations d’intensité dans les défaillances systématiques, simplifier la détection des changements structurels dans les spectres de l’échantillon. Effectuez une correction de base pour augmenter la comparabilité entre les différentes expériences.

Analysez les spectres Raman à l’aide de l’analyse en composantes principales ou PCA avec le logiciel de redressement. Cette analyse multivariée détecte les différences et les similitudes au sein des ensembles de données spectrales. Chaque spectre est tracé comme un point unique dans un espace multidimensionnel sur la base des comptages collectés pour chaque décalage de ramen.

Chaque composant principal, abrégé en PC, décrit une certaine quantité de l’ensemble des informations contenues dans les données d’origine. Le premier PC est celui qui contient la source de variation la plus élevée. Chaque PC suivant contient dans l’ordre moins d’informations que le précédent.

Chaque variable a un score et un chargement sur chaque PC.By traçant des PC, des corrélations d’échantillons importantes peuvent être exposées. Les chargements décrivent la contribution de chaque variable analysée à l’ACP. Étiquetez chaque groupe de mesures en créant des plages de lignes pour chaque groupe d’échantillons, utilisez les paramètres de base suivants pour la validation croisée PCA, l’algorithme Nip Al, pas de rotation, et démarrez l’analyse.

Ces paramètres dépendent des spectres. Enfin, les spectres de ramen bruts PCA générés à partir de cellules adhérentes révèlent souvent un faible rapport signal/bruit et une faible intensité globale du signal. La mise au point laser doit être réglée près du fond en verre, ce qui masque le signal d’échantillon réel.

Par conséquent, le signal d’échantillonnage peut être minimisé, voire éliminé, lors d’une soustraction ultérieure de l’arrière-plan. À l’inverse, les cellules et la suspension permettent de détecter des informations spectrales plus détaillées. Cependant, les spectres des cellules adhérentes et en suspension présentent les mêmes pics principaux ne différant que par leurs intensités entités pour la caractérisation de différents types de cellules au sein d’une suspension, aucun prétraitement n’est nécessaire.

Les spectres Raman moyens et les écarts-types des fibroblastes humains, des cellules souches mésenchymateuses, des chondrocytes et des kératinocytes mesurés en suspension sont représentés ici. Tous les spectres de ramen sont structurés de la même manière, avec des pics provenant de biomolécules typiques telles que les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Pour ces types de cellules, la région spectrale entre les numéros d’onde 601 et 800 contient les informations spectrales les plus pertinentes qui permettent de détecter des différences claires entre les différents types de cellules.

Par exemple, une région spectrale présente des différences structurelles claires, qui peuvent être attribuées aux vibrations moléculaires du collagène et des lipides. En revanche, les analyses morphologiques ne sont pas adaptées à l’identification et à la distinction de la plupart des cellules. Bien que la différence entre les chondrocytes et les cellules de la peau soit observable, les fibroblastes et les cellules souches mésenchymateuses sont difficiles à séparer.

En utilisant uniquement la microscopie à champ clair pour l’attribution de tissus natifs à un spectre d’empreintes digitales spécifique, des spectres Raman ont été générés à partir de protéines pures disponibles dans le commerce et de cryosections immuno-histologiquement colorées. Ici, les spectres d’empreintes digitales des fibres élastiques ont été identifiés dans les tissus natifs en comparant des coupes cryogéniques lyophilisées, colorées à l’élastine et par immunofluorescence marquées à l’aide d’un anticorps contre l’élastine. Cependant, étant donné que l’élastine présente une autofluorescence élevée, qui se reflète dans les spectres Raman, l’analyse des données est difficile à réduire l’échec systématique en raison des propriétés spécifiques de l’échantillon telles que l’autofluorescence et le traitement approprié des ensembles de données est crucial.

Dans l’analyse des données. La normalisation a été utilisée pour éliminer l’intensité du signal significativement plus élevée de la protéine d’élastine pure, ce qui a permis d’obtenir des spectres Raman comparables. L’élastine est l’une des protéines de la matrice extracellulaire les plus stables du corps et est donc très difficile à dégrader. Ici.

La dégradation de l’élastine a été induite dans les feuillets valvulaires aortiques porcins sains en effectuant une digestion enzymatique en appliquant l’analyse multivariée, des différences significatives de PCA ont été identifiées entre les spectres Raman des échantillons traités enzymatiquement et les témoins natifs. Ces différences spectrales ont été observées dans le spectre de charge aux numéros d’onde 861 1003 et 1 664 Les changements structurels attendus dans les fibres contenant de l’élastine en raison de temps d’exposition prolongés à l’élastase se sont reflétés dans un score séparable plus distinct. Ces changements structurels attendus sont également évidents dans les feuillets de la valve aortique porcine colorée du cœur, comme le montre cet encadré en comparant le témoin non traité avec les échantillons de tissus qui ont été exposés à l’enzyme élastine élastine pendant 30 minutes.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et matricielle ainsi que de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire pour effectuer non seulement une analyse phénotypique cellulaire en temps réel, mais aussi pour identifier les interactions cruciales entre les cellules cellulaires et la matrice cellulaire en Z deux dans un environnement natif.