L'imagerie non invasive de la candidose disséminée chez les larves poisson zèbre

L’objectif général de cette procédure est de démontrer des techniques d’infection des larves de poisson-zèbre à l’aide de l’agent pathogène fongique Candida albicans. Tout d’abord, une culture fongique fluorescente est préparée et les embryons de poisson sont enrobés. Ensuite, les poissons sont alignés sur un plat d’injection d’aros.

Candida albicans est micro-injecté par l’oreille de chaque poisson dans le cerveau postérieur et le ventricule de pêcheur, puis incorporé dans des aéros à faible point de fusion et visualisé par microscopie à fluorescence épi. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour imager de manière non invasive l’interaction hôte-pathogène dans l’environnement complexe de l’hôte plutôt que le système simplifié de la boîte de Pétri. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’injection dans la veine du dorlotet est que vous créez une infection localisée qui entraîne une maladie disséminée mortelle.

De plus, cette technique permet d’injecter efficacement les cellules intrinsèquement grandes de C bucan dans de petites larves de poisson-zèbre. Commencez par faire spérer un bouillon de candida albican sur une levure. La plaque de gélose au dextrose incube la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux colonies de se développer.

Une fois que les colonies sont visibles, utilisez une cheville en bois stérile pour cueillir une colonie isolée et dissoudre la levure dans cinq millilitres de bouillon de levure fraîche Extrait Pepto dextrose dans des tubes de culture de 16 x 150 millimètres. Placez la culture sur un tambour à rouleaux de culture tissulaire, équipé d’une roue en éprouvette et d’incubateurs pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez un millilitre de la culture dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez-le à 14 000 fois, G pendant une minute pour granuler les cellules, puis jetez le supinate et vortex la pastille pour la détacher.

Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de vortex PBS et centrifugez-les à nouveau. Jetez ensuite le supinat et répétez ce lavage. Pas trois fois pour éliminer tout milieu de culture résiduel.

Une fois les cellules lavées, comptez-les dans un hémocytomètre à une dilution de un à 100 dans le PBS. Pour une culture de 12 heures, vous devez vous attendre à trois à quatre fois 10 à huit cellules par millilitre. Reese’s plie la levure à une concentration finale de 10 à sept cellules par millilitre.

À l’aide d’un tamis, prélevez les embryons de poisson-zèbre dans un bassin de ponte la veille de l’injection et conservez-les dans une solution d’eau d’œuf contenant 60 milligrammes par millilitre de sels de mer instantanés dans de l’eau déminéralisée stérile. Placez ensuite les embryons à 33 degrés SIU pendant 24 heures avec un cycle d’obscurité légère de 12 heures. Cela permet le développement de l’embryon jusqu’au stade larvaire prim 25, le stade optimal pour l’infection le jour de l’infection.

Transférez les embryons à l’aide d’une pipette de transfert dans 60 millilitres d’eau d’œuf dans une boîte de Pétri très profonde. Ensuite, l’utilisateur dissection au microscope et à la pince à épiler Dumont pour découper les embryons. Cela peut être réalisé en séparant doucement le Corian comme un sac de chips jusqu’à ce que le poisson ressorte.

Une fois que tous les embryons ont été découverts. Ainsi, pendant que la boîte de Pétri déplace le poisson vers le centre, transférez le poisson sur le couvercle du plat, retirez le milieu et remplacez-le par de l’eau d’œuf fraîche. Ajouter le poisson à l’eau fraîche des œufs.

Préparez une solution de 200 microgrammes par millilitre de sulfonate de trica méthane pour anesthésier le poisson à l’aide d’une pipette de transfert. Prélevez de 20 à 50 embryons et replacez-les dans la solution anesthésique pendant une à deux minutes ou jusqu’à ce qu’ils cessent de bouger. Pendant ce temps, allumez l’unité d’injection, en vous assurant que les interrupteurs de pression sont activés par impulsion et que la durée de l’impulsion est réglée sur neuf avec trois PSI pour l’unité de contre-pression.

Ouvrez progressivement la vanne du réservoir d’azote jusqu’à ce que la pression d’injection atteigne 30 PSI. Ensuite, chargez la micro-pipette groupée avec cinq microlitres de solution vortex candida albican et placez-la dans le porte-micro-pipette. Placez une boîte de Pétri très profonde contenant de l’eau sur la platine du microscope de dissection et ajustez la position des micropipettes jusqu’à ce qu’elle soit visible et que sa pointe ne soit que partiellement immergée dans l’eau.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, coupez l’aiguille de la pipette à environ trois millimètres de la pointe. Si l’aiguille a été clipsée avec succès, une pression sur la pédale de commande de l’unité d’injection devrait permettre de distribuer le liquide. À l’aide d’une lame graduée, mesurez le volume distribué, puis ajustez la pression de sorte que le volume de liquide distribué ait un diamètre de 0,21 millimètre, soit juste en dessous de la taille de la pupille d’un embryon de poisson zèbre.

Une fois le microscope installé et les poissons anesthésiés, gonflez le plat pour attirer les poissons vers le centre et faites-les remonter dans une pipette de transfert. Tapotez délicatement le côté de la pipette pour que le poisson se dépose à l’extrémité. Ensuite, en utilisant le moins de volume possible, déposez délicatement le poisson dans un plat d’injection de larves d’aose préchauffé à 28 degrés Celsius.

À l’aide d’une tige de verre lisse, alignez soigneusement le poisson. Ensuite, avec une serviette en papier, retirez autant de liquide que possible du plat. Placez la coupelle avec le poisson sous le microscope jusqu’à ce que l’aiguille et le premier poisson soient bien visibles.

Assurez-vous que chaque poisson est toujours en vie en observant la présence d’un battement de cœur visible. S’il est mort, jetez-le et passez au suivant. Déplacez l’aiguille de verre vers le poisson en zoomant.

Ce faisant, insérez soigneusement l’aiguille dans la structure circulaire de l’oreille du poisson avec deux pierres d’oreille situées juste derrière l’œil. Une fois l’aiguille en place, injectez la levure à l’aide de l’interrupteur au pied. Si l’aiguille est correctement insérée, le cerveau postérieur du ventricule se détachera légèrement après l’injection, rétractera l’aiguille et répétera la procédure avec le poisson suivant.

L’ensemble du processus ne devrait pas prendre plus de 15 ou 20 minutes, sinon le poisson se dessèchera et mourra après ce temps. La levure se déposera également dans le fond de la micropipette et entraînera une infection inégale, des doses et/ou un colmatage de la micropipette groupée. Une fois que tous les poissons ont été injectés, utilisez de l’eau d’œuf pour les laver et les mettre dans une boîte de Pétri fraîche contenant 60 millilitres d’eau d’œuf.

Placez ensuite le plat à 28 degrés Celsius. Fermez la vanne d’azote, réglez l’interrupteur d’injection sur continu pour relâcher la pression dans la conduite du réservoir. Ensuite, lorsque la pression tombe à zéro, remettez l’interrupteur sur impulsion et éteignez l’unité d’injection.

Commencez par anesthésier le poisson infecté dans du sulfate de trica méthane comme décrit précédemment. Une fois les poissons anesthésiés, utilisez une pipette pour transférer un poisson à la fois dans une boîte de Pétri contenant 0,4 % de gélose à faible point de fusion. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert et en transportant le moins d’agros possible.

Transférez chaque poisson de la boîte de Pétri dans un puits d’une boîte d’imagerie à fond de verre à environ 0,2 millilitre et 0,4 % de faible fondre, complété par 200 microgrammes par millilitre d’anesthésique sur le poisson de sorte que les cercles intérieurs soient remplis et qu’une fine couche d’aros s’étale au fond du puits. Le poisson peut maintenant être imagé jusqu’à 24 heures à l’aide d’un microscope inversé avec un système confocal à balayage laser. Cinq heures après avoir infecté le poisson zèbre avec du candida albicans rouge fluorescent.

La levure est visible dans le cerveau postérieur du poisson chez les poissons FL I un EGFP, comme ceux-ci, l’endothélium vasculaire et les cellules ressemblant à des macrophages dans tout le corps du poisson sont fluorescentes. Ils sont représentés ici en vert, cinq heures après l’infection. La levure peut être observée dans les cellules de type macrophage dans les 24 heures.

L’infection s’est propagée le long du tissu dorsal de la queue où la levure peut à nouveau être détectée dans les cellules FTIC. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-injecter du candida albicans dans le ventricule du cerveau postérieur du poisson-zèbre de stade Prim 25, y compris un préparant la culture fongique, deux anesthésiants des larves de poisson-zèbre. Trois micro-injections dans le ventricule du cerveau postérieur.

Et quatrièmement, la préparation des larves infectées pour l’imagerie confocale.