Name: Lappauvrissement de lARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Apprenez à appauvrir l'ARN ribosomique dans les échantillons d'intestin de moustique pour enrichir l'ARN messager et améliorer l'analyse RNA-seq. Cette méthode atteint 90-99% de déplétion.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subvention 1SC2GM092789-01A1, et MS était un érudit de la recherche NMSU Howard Hughes Programmes Établissement de recherches médicales de premier cycle. La vidéo a été réalisé et produit par Amy Lanasa et coordonné par le Dr Philip Lewis avec le Creative Media Institute à NMSU.

Procédure 1. Élevage Mosquito <ol><li> Arrière moustique Anopheles gambiae G3 souche dans un insectarium à 27,5 ° C avec une humidité de 80% et le cycle h 12:12 de lumière / obscurité. </li><li> Les larves se nourrissent de la nourriture pour chat au sol avec de la levure de bière avec un rapport de 1:1. </li><li> Nourrir les moustiques adultes sur le sang des souris au jour 3 post-levée pour la production d&#39;œufs. </li></ol> 2. Dissection intestin du moustique <ol><li> Outils de dissection autoclave (diapositives et des pinces). </li><li> Recueillir 50 moustiques à l&#39;aide d&#39;un aspirateur et placez-les sur le lit de CO débit 2 (Ultimate Flypad). Rincer une éprouvette moustique séquentiellement dans trois boîtes de Pétri contenant de l&#39;éthanol à 70% pour nettoyer la surface du corps des moustiques. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur une lame de verre sous un stéréomicroscope. Retirez le tube digestif. </li><li> Recueillir 50 tripes par condition pour l&#39;isolation d&#39;ADN métagénomique. Recueillir 50 tripes par condition d&#39;isolement d&#39;ARN métagénomique. </li></ol&gt; 3. Isolement de l&#39;ADN métagénomique Remarque: l&#39;ADN métagénomique est isolé en utilisant la méta-G-Nome ADN Isolation Kit (Biotechnologies Epicentre) avec la modification décrite ci-dessous. <ol><li> Place 50, tripes de moustiques dans 300 pi de TE. Les homogénéiser pendant 1 min à l&#39;aide de Bio-Gen PRO200 homogénéisateur (PRO Scientific Inc, États-Unis) à la vitesse de 2000 tours sur la glace. </li><li> Ajouter 2 ul de solution de lysozyme Prêt-Lyse et 1 pl de RNase A à la suspension cellulaire. Mélanger au vortex et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 300 ul de méta-Solution de Lyse (2X) et 1 ul de protéinase K dans le tube. Mélanger au vortex. Brièvement impulsions centrifuger le tube de sorte que l&#39;ensemble de la solution est dans le fond du tube, et incuber à 65 ° C pendant 15 min, refroidir à température ambiante, puis mettre dans la glace pendant 3-5 min. </li><li> Ajouter 350 ul de réactif MPC Protein Precipitation au tube et vortexer vigoureusement pendant 10 secondes. </li><li> Pellet tIl débris par centrifugation pendant 10 min à 12000 xg à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un endroit propre de 2 ml tube et jeter le culot. </li><li> Ajouter 570 ul d&#39;isopropanol au surnageant. Mélanger à la fois le tube retournant plusieurs. </li><li> Pellet l&#39;ADN par centrifugation pendant 10 min à 12000 xg à 4 ° C. Retirer l&#39;isopropanol sans déloger le culot d&#39;ADN. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol 75% à laver le culot. Centrifuger pendant 5 min à 12000 xg à 4 ° C. Éliminer l&#39;éthanol sans perturber le culot d&#39;ADN. Air sécher le culot à température ambiante pendant 2 min. Note: Ne pas trop sécher le culot d&#39;ADN. </li><li> Remettre en suspension le culot d&#39;ADN dans 50 pl de tampon TE. </li><li> Valider la taille de l&#39;ADN isolé par rapport à l&#39;ADN de contrôle fosmide (40 ko, 100 ng / ul) fourni dans le kit, par électrophorèse sur gel sur un gel d&#39;agarose 1%. </li></ol> 4. Isolation d&#39;ARN total Remarque: Nettoyer la zone de travailavec RNaseZap pour minimiser la contamination de RNase. Métagénomiques ARN a été isolé à partir d&#39;échantillons intestinaux moustiques en utilisant le réactif d&#39;isolement Tripure (Roche) avec une modification mineure. <ol><li> Mettre 50 tripes de moustiques dans un tube de 2 ml avec 500 ul de réactif Tripure isolement. Homogénéiser pendant 1 min à vitesse 2000 tours sur la glace à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 min pour permettre la dissociation des complexes de nucléoprotéines. </li><li> Ajouter 100 ul de chloroforme et homogénéiser au vortex pendant 12 secondes et laisser reposer à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Centrifuger à 10000 g pendant 10 min. Sortez soigneusement le tube sans déranger les phases ont été séparées. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, ajouter 250 ul d&#39;isopropanol, bien mélanger et mettre à -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C à l&#39;ARN précipité. </li><li> Jeter le surnageant sans déloger granulés. Laver le culot avec 750 ul d&#39;éthanol à 75%. </li><li> Introduire à la pipette le surnageant sans déranger le culot. Air sécher le tube pendant 2 min. </li><li> Remettre en suspension l&#39;ARN avec 30 pl d&#39;eau nucléase libre. </li><li> Traiter les ARN totaux avec de la DNase à 37 ° C pendant 20 min, puis inactiver la DNase par incubation à 75 ° C pendant 15 min. ARN précipité avec de l&#39;éthanol et remettre en suspension l&#39;ARN dans 30 pl d&#39;eau nucléase libre. </li><li> Déterminer la quantité d&#39;ARN total en utilisant un NanoDrop. </li></ol> 5. Ribosomal RNA épuisement Remarque: Le protocole a été élaboré sur la base des méthodes décrites précédemment 12,13,15. <ol><li> Amplification par PCR de l&#39;ARN ribosomal fragments de gènes Cette étape crée pools d&#39;échantillons spécifiques ARNr, qui seront utilisés comme modèles pour la transcription in vitro pour produire des anti-sens ARN ribosomal (arRNA) sondes qui sont complémentaires à l&#39;ARNr de l&#39;échantillon d&#39;ARN total. <ol><li> Concevoir et synthétiser des ensembles d&#39;amorces pour l&#39;ARNr fragment de PCR (tableau 1). </li><li> Exécuter PCR dans 50réaction ul utilisant l&#39;ADN polymérase Taq (Qiagen) avec 50 ng de matrice d&#39;ADN, 1 x tampon PCR, 1,5 mM Mg 2 Cl, 0,2 uM amorces avec 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 10 sec, 15 sec de recuit à 40 ° C pour bactérienne amplicon 23S et 50 ° C pour les amplicons d&#39;autres, et s&#39;étendant à 72 ° C pendant 1 min (extension finale à 72 ° C pendant 5 minutes). </li><li> Voir les produits de PCR sur gel d&#39;agarose 1%. </li><li> Purifier produits de PCR utilisant le kit de purification de PCR QIAquick avec élution dans 50 ul de tampon d&#39;élution. Quantifier la concentration en utilisant NanoDrop. </li></ol></li><li> La transcription in vitro de la biotine-sondes marquées ARNr anti-sens (arRNA). Remarque: Dans cette étape, les sondes de prélèvement spécifiques des différents amplicons d&#39;ARNr sont synthétisés en utilisant le kit MEGAscript T7. <ol><li> Mettre en place une réaction de 20 ul pour chaque amplicon spécifique ARNr de l&#39;échantillon en mélangeant les ingrédients ci-dessous (Tableau 2). Incuber une nuit à 37 ° C. <strong&gt; Remarque: en général, les rendements de réaction&gt; 50 pg d&#39;ARN. </li><li> Ajouter 1 ul de DNase I (inclus dans le kit) à la réaction et incuber à 37 ° C pendant 20 min pour éliminer la matrice d&#39;ADN. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;éthanol à 100% pour la réaction, centrifugeuse à 12.000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour précipiter synthétisé arRNA. Rejeter le surnageant et laver le culot avec 750 ul d&#39;éthanol à 75%. Remettre les sondes d&#39;ARN dans 50 pi d&#39;eau nucléase libre. </li><li> Quantifier la concentration d&#39;ARN en utilisant une NanoDrop. Sondes Conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> ARNr soustraction avec biotinylé arRNA. Remarque: Cette étape utilise le arRNA biotinylé de s&#39;hybrider à l&#39;ARNr de l&#39;échantillon d&#39;ARN total. Les hybrides ARNr arRNA sont capturés par la streptavidine billes magnétiques revêtues. La procédure est basée sur le protocole décrit dans la référence 13 avec des modifications mineures. <ol><li> Réactifs <ol><li> Préparer NaOH 0,1 N, 20X chlore de sodiumide-citrate (SSC) et 1 X SSC avec 20% de formamide. </li></ol></li><li> Hybridation <ol><li> Mélanger 1 ug d&#39;ARN total avec 16S et 23S sondes (0,75 pg chacun), 18S moustiques et les sondes 28S (0,75 mg chacune), 1 inhibiteur de RNase, 2,5 pl 20X tampon SSC, 10 ul de formamide à 100% dans un 200 tube de PCR ul , ajouter eau sans nucléase à 50 pi. </li><li> Placer le tube de réaction dans un thermocycleur et incuber à 70 ° C pendant 5 minutes pour ouvrir la structure secondaire et de descente de la rampe 25 ° C en utilisant 5 ° C par incréments de 1 min chacune ° C pour permettre l&#39;hybridation de sondes d&#39;ARNr et arRNA. </li></ol></li><li> Suppression de l&#39;ARNr <ol><li> Transfert 300 pi billes revêtues de streptavidine dans un tube de 1,7 ml. Placer le tube sur une grille de séparation magnétique pour immobiliser les billes. Retirer le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 300 ul de NaOH 0,1 N et mix bien. Placer le tube arrière du rack magnétique et pipeter le surnageant. Remettre en suspension les perles dans 300 pi de SSC 1X, mélangez bien, immobiliser les billes et pipeter le surnageant. Répéter le lavage avec 300 pl de 1X SSC une fois de plus. </li><li> Assurez-3 aliquotes de perles, 100 ul chacun, dans 1,7 ml tubes. Placer le tube sur le support magnétique, et retirer le surnageant par pipetage. Remarque: Les aliquotes de perles sont utilisées pendant 3 rounds de capture biotinylés ARNr arRNA hybrides. </li><li> Ajouter 50 ul 1X SSC avec 20% de formamide dans la réaction de 50 ul hybridation. Transférer la réaction dans le tube aliquote premier talon, et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux biotinylés sonde ARNr hybrides à être capturés par des billes de streptavidine. Balayez le tube toutes les 2 minutes pour mélanger pendant l&#39;incubation. </li><li> Placer le tube sur le support magnétique pour immobiliser les billes, transférer le surnageant de la seconde aliquot de perles, bien mélanger et incuber comme ci-dessus. Effectuer la capture troisième surnageant par transfert dans le troisième tube de perles. Mélanger et incuber. </li><li> Transfert non-ARNr surnageant dans un nouveau tube et la purification conduite en utilisant RNeasy kit MinElute pour enlever le formamide suivant le manuel du fabricant. </li><li> Contrôler l&#39;efficacité de l&#39;appauvrissement de l&#39;ARNr en utilisant un Agilent RNA 6000 Pico Kit de puce sur une Bioanalyzer (figure 4). </li></ol></li></ol></li></ol> Remarque: Les ARNr appauvri d&#39;échantillons d&#39;ARN sont soumis à l&#39;ARNm d&#39;amplification si nécessaire 8.

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Une communauté microbienne complexe réside dans l&#39;écosystème intestin du moustique, 14,16,17. Metatranscriptomic séquençage (ARN-seq) peut révéler des informations de contexte dépend fonctionnelle en interrogeant la totalité du transcriptome 4,18 microbienne. Techniquement, oligo-d (T) d&#39;enrichissement de l&#39;ARNm procaryote médiation n&#39;est pas applicable en raison de l&#39;absence de stabilité poly (A) queues des messagers. Alternativement, l&#39;appauvrissement de l&#39;ARNr a été u...

La technologie de séquençage de nouvelle génération a beaucoup progressé étude métagénomique en permettant d&#39;évaluer la composition taxonomique et génétique d&#39;une fonctionnalité associations microbiennes. Séquençage d&#39;ARN (RNA-Seq) 1 peut contourner culture à base de méthodes pour étudier metatranscriptomes microbiennes dans 2-5 contextes différents. Un obstacle majeur à microbien ARN-seq est la difficulté à enrichir l&#39;ARNm, comme les espèces d&#39;ARNm procaryotes ne sont pas stable polyadénylé. Par conséquent, oligo d (T) l&#39;enrichissement messager médiation n&#39;est pas applicable. Suppression de l&#39;ARNr abondante est une approche alternative pour enrichir l&#39;ARNm. Trousses commerciales d&#39;épuisement ARNr, comme Microexpress kit ARNm enrichissement bactérien (Ambion), RiboMinus Isolation Kit transcriptome (bactéries) (Life Technologies), et l&#39;ARNm UNIQUEMENT kit d&#39;isolation d&#39;ARNm procaryote (Epicentre) qui dégrade préférentiellement ARNr avec une exonucléase, ont été utilisés de suppression de l&#39;ARNr 6-8. Cependant, les sondes de capture dans Microexpressou RiboMinus sont bons pour enlever ARNr connu de types de bactéries Gram-positives et Gram-négatives (voir les spécifications du fabricant), mais moins compatible avec les ARNr des microbes inconnus. Par conséquent, la suppression peut être moins efficace pour les 8-10 des échantillons métagénomique. Par ailleurs, la fidélité abondance de l&#39;ARNm était discutable lorsque le traitement a été appliqué exonucléase 11. Dans l&#39;ensemble, la soustraction basée sur l&#39;appauvrissement de l&#39;ARNr est moins biaisé et plus efficace dans l&#39;enrichissement d&#39;ARNm dans les paramètres métagénomiques 10-13. L&#39;intestin du moustique, accueille une communauté microbienne dynamique 14. Nous cherchons à caractériser la fonction du microbiome intestin du moustique en utilisant l&#39;ARN-Seq. Dans un échantillon d&#39;ARN isolés à partir des entrailles de moustiques, les deux ARN moustiques et des microbes sont présents. Ici, nous décrivons un protocole modifié d&#39;utiliser des sondes ARNr communautaires spécifiques pour épuiser les ARNr efficacement les moustiques et microbienne par hybridation soustractive. L&#39;ARNm résultantéchantillons enrichis sont appropriés pour l&#39;ARN-Seq. Le flux global est représenté dans la figure 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material </td></tr><tr><td>Kit d’isolement d’ADN Meta-G-Nome</td><td>Epicentre</td><td>MGN0910</td><td>Isolement d’ADN métagénomique</td></tr><tr><td>TriPure </td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>Mdetagenomic</td></tr><tr><td>DNA Isolation MEGAscript T7</td><td>kit Ambion</td><td>AM1334</td><td>Synthèse in vitro de sondes d’ARN</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNase zone de travail libre </td></tr><tr><td>Biotine-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td>Synthèse in vitro de l’ARN</td></tr><tr><td>Biotine-11-CTP</td><td>Roche</td><td>4739205001</td><td>Synthèse in vitro de l’ARN</td></tr><tr><td>Billes magnétiques de streptavidine</td><td>NEB</td><td>S1420S</td><td>Capture d’hybrides d’ARNr</td></tr><tr><td>Rack de séparation magnétique</td><td>NEB</td><td>S1506S</td><td>Capture d’hybrides d’ARNr</td></tr><tr><td>Mini kit facile</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Purification de l’ARN soustrait</td></tr><tr><td>Ensemble de DNase sans RNase</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Élimination de la contamination de l’ADN </td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico</td><td>Kit Agilent Technologies Inc.</td><td>5067-1513</td><td>Électrophérogramme de l’ARN</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Bio-Gen PRO200 Homogénéisateur</td><td>PRO Scientific</td><td>01-01200</td><td>Homogénéisation du tissu intestinal des moustiques</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotomètre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>DNA & Quantification de l’ARN</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>G2940CA</td><td>Électrophérogramme de l’ARN</td></tr></tbody></table>

l&#39;appauvrissement de l&#39;arn ribosomique pour métagénomique gut mosquito arn-seq

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

L&#39;intestin du moustique, accueille les communautés microbiennes dynamiques à travers les différentes étapes du cycle de vie de l&#39;insecte. Caractérisation de la capacité génétique et la fonctionnalité de la communauté intestin permettra de mieux comprendre les effets du microbiote intestinal sur les traits de vie des moustiques. Métagénomique RNA-Seq est devenu un outil important pour analyser les transcriptomes de divers microbes présents dans une communauté microbienne. L&#39;ARN messager comprend généralement que 1-3% de l&#39;ARN total, tandis que ARNr constitue environ 90%. Il est difficile pour enrichir l&#39;ARN messager à partir d&#39;un échantillon d&#39;ARN microbienne métagénomique, car la plupart des espèces d&#39;ARNm procaryotes n&#39;ont pas stables poly (A) des queues. Cela empêche oligo d (T) isolement d&#39;ARNm médiée. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie échantillon dérivé ARNr des sondes de capture pour enlever ARNr partir d&#39;un échantillon d&#39;ARN total de métagénomique. Pour commencer, à la fois contre les moustiques et microbiennes petits et grands fragments d&#39;ARNr sous-unités sont amplifiés à partir d&#39;un échantillon d&#39;ADN métagénomique communauté. Ensuite, la communautécommunautaires spécifiques biotinylés antisens ribosomique sondes d&#39;ARN sont synthétisés in vitro en utilisant l&#39;ARN polymérase T7. Les sondes biotinylées ARNr sont hybridées à l&#39;ARN total. Les hybrides sont capturés par des billes revêtues de streptavidine et retiré de l&#39;ARN total. Ce protocole basé sur la soustraction élimine efficacement à la fois contre les moustiques et l&#39;ARNr microbienne de l&#39;échantillon d&#39;ARN total. L&#39;échantillon enrichi en ARNm est ensuite traité pour l&#39;amplification de l&#39;ARN et ARN-Seq.

Le protocole comprend trois sections: (1) la préparation de matrices d&#39;ADN métagénomique pour l&#39;ARNr PCR, (2) la création d&#39;échantillonnage des sondes spécifiques de l&#39;ARNr de capture, (3) l&#39;épuisement de l&#39;ARNr de l&#39;ARN total par hybridation soustractive. Isolation de haute qualité métagénomique ADN et l&#39;ARN est essentielle pour l&#39;ensemble du processus. Le protocole modifié Meta-G-Nome isolement de l&#39;ADN de haute qualité donne ADN métagénomique de viscères de moustiques, comme le...

Un protocole d&#39;ARN ribosomal épuisement (ARNr) a été développé afin d&#39;enrichir l&#39;ARN messager (ARNm) pour l&#39;ARN-seq de la metatranscriptome intestin du moustique. Les sondes de prélèvement ARNr spécifiques, qui ont été utilisés pour retirer l&#39;ARNr par soustraction, ont été créés à partir du moustique et ses microbes intestinaux. Performances du protocole peut entraîner la suppression d&#39;environ 90-99% de l&#39;ARNr.

L&#39;appauvrissement de l&#39;ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Bonjour à tous. Il s’agit de Fana Kla du laboratoire du Dr Xenon Zu, du département de biologie de l’Université d’État du Nouveau-Mexique. Nous travaillons sur la métagénomique de l’écosystème intestinal des moustiques.Aujourd’hui, nous allons démontrer votre processus A pour appauvrir l’ARN ribosomique à partir des échantillons d’ARN totaux afin d’enrichir l’ARN messager, ARN pour RNA-Seq. Le RNA-Seq est une technique largement utilisée pour étudier les fonctions de la communauté microbienne. Tout d’abord, je vais vous montrer comment isoler l’ARN total et l’ADN métagénomique de l’intestin musculaire.Les moustiques Analys Gambia sont maintenus à une insurrection. Les moustiques sont d’abord nourris avec de la farine de sucre, puis les moustiques femelles sont nourris avec des souris pour la production d’ACHE. Ces moustiques sont nourris avec du sucre et ceux-ci sont nourris avec du sang de souris.Avant l’intervention, tous les outils et lames de dissection ont été stérilisés. Les moustiques sont nettoyés trois fois dans une boîte de Pétri avec de l’éthanol à 70 %, puis remis sur une lame de verre pour sécher l’éthanol, placez les moustiques sur une autre lame de verre et mettez une goutte de solution stérile un XPBS. Ensuite, retirez doucement l’intestin.Les entrailles du moustique seront utilisées pour obtenir respectivement de l’ADN métagénomique et de l’ARN total. Avant de commencer le travail sur l’ARN, il est important de prendre les précautions standard pour éviter la dégradation de l’ARN en maintenant un environnement exempt de ribonucléase tout en portant des gants, en nettoyant les pipettes de la zone de travail et tous les appareils requis avec de la sève. Avant l’intervention, prélevez 50 tripes et placez-les dans un tube einor de 1,5 millilitre contenant des réactifs de pu.Pour l’isolement génomique de l’ARN total, l’ADN est isolé d’un autre lot de 50 intestins à l’aide d’un kit d’isolement métagénomique. La concentration d’ARN ou d’ADN est mesurée à l’aide de NanoDrop. Nous avons utilisé notre soustraction d’ARN pour retirer l’ARN ribosomique de l’échantillon total d’ARN.Tout d’abord, les fragments d’ARNr spécifiques à l’échantillon sont amplifiés par PCR à partir de l’ADN génomique, que nous avons prélevé sur les échantillons intestinaux. Les produits PCR sont purifiés à l’aide d’un kit de purification PCR Qiagen. Dans cette étape, l’ARN polymérase T sept est utilisée pour synthétiser des sondes ARNr antisens.Mettre en place une réaction à l’aide du produit PCR de la première étape et du CTP et UTP biotinylés. Ensuite, incubez la réaction pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Les sondes antisens à ARNR sont maintenant prêtes à être utilisées pour l’appauvrissement de l’ARNr.Cette étape utilise des sondes d’ARNR BIOTINYLÉES pour capturer l’ARNr cible dans l’échantillon d’ARN total, l’ARNr cible et la sonde d’ARNr. Les hybrides sont ensuite capturés par des billes magnétiques enrobées de division streptococcique. Installez la réaction d’hybridation dans un tube PCR et incubez-la dans un thermocycleur pendant cinq minutes à 70 degrés Celsius.Baissez ensuite la température à 25 degrés Celsius. Pour permettre l’hybridation de l’ARNR pendant que la réaction se déroule, préparez les billes. Tout d’abord, faites trois aliquotes.Utilisation de billes de 100 microlitres par tube. Lavez les perles avec une solution XSSC trois fois. Laissez ensuite les tubes sur de la glace.Une fois la réaction prête, diluée en ajoutant 100 microlitres d’un XSSC avec 20 % d’amide de forme. Transférez la solution réactionnelle dans le tube avec les billes. Bien mélanger puis incuber à température ambiante pendant 10 minutes.En agitant le tube de temps en temps, faites-le tourner brièvement et placez-le sur le support magnétique. Transférez le super natin dans un tube de collecte. Lavez les perles deux fois de plus, chacune avec 100 microlitres.Ajout d’une solution tampon XSSC. Mélangez bien puis récupérez les billes sur la grille magnétique. Transférez les surnageants dans le tube de collecte.Nous avons maintenant un échantillon d’ARN appauvri en ARNR dans le tube. Effectuez la purification à l’aide du minikit RN easy de Qiagen. En suivant les instructions, nous vérifions maintenant l’efficacité de l’épuisement.Les échantillons d’ARN sont chargés sur une puce Agilent RNA 6 000 PICO et passés par le bioanalyseur 2100. Avant la soustraction. Il y avait deux pics d’ARN ribosomique de 16 s et 23 s respectivement.Après la soustraction, les pics d’ARNr ont été efficacement éliminés. L’ARN restant est dans la gamme de taille de 200 paires de bases à quatre kilobases. L’échantillon d’ARN est maintenant prêt à constituer une banque de CD NA pour le séquençage du transcriptome.Nous vous guidons simplement à travers la procédure d’enrichissement du messager, ARN pour ARN. Chercher. Merci de nous avoir regardés.

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Source : Liu, X., et al. Un test oral bactérien avec des moustiques traités aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’appauvrissement du microbiote intestin naturel chez les moustiques à l’aide d’une solution contenant des antibiotiques en saccharose. Cela est suivi d’une recolonisation contrôlée avec une suspension bactérienne délivrée via un système d’alimentation membranaire afin d’établir une population bactérienne définie dans l’intestin du moustique.

Établissement d’une population bactérienne intestinale définie chez les moustiques adultes

Les analyses RNA-Seq deviennent de plus en plus importantes pour identifier les fondements moléculaires des traits adaptatifs dans les organismes non modèles. Ici, un protocole permettant d’identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les moustiques Aedes albopictus diapause et non diapause est décrit, de l’élevage des moustiques au séquençage de l’ARN et aux analyses bioinformatiques des données RNA-Seq.

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l'article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d'approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d'origine animale associée.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

Un protocole permettant de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARNr bactérien 16S des sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. La méthodologie comprend la co-extraction de l’ADN et de l’ARN ; préparation d’ARN libre d’ADN ; et la quantification du gène et du transcrit de l’ARNr 16S par RT-q-PCR, y compris la construction de la courbe standard.

ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.

Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

Cet article présente un protocole pour étudier l’effet des bactéries intestinales des moustiques individuelles, y compris l’isolement et l’identification des microbes cultivables midgut moustique, l’épuisement antibiotique des bactéries intestinales des moustiques, et réintroduire une espèce spécifique de bactéries.

Un test d’alimentation orale bactérienne avec des moustiques traités aux antibiotiques

Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Isolement de l’ARN fécal (micro)

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Les communautés microbiennes chez les moustiques sont très prometteuses pour les stratégies de biocontrôle vectoriel. La plupart des symbiotes sont incultivables et nécessitent des analyses métagénomiques. Nous décrivons une méthode pour disséquer les moustiques femelles et séparer les ovaires, l’intestin moyen et les glandes salivaires, en évitant la contamination croisée, en facilitant les études du microbiome au niveau des organes et en améliorant la compréhension des rôles des...

Dissection des ovaires, de l’intestin moyen et des glandes salivaires de moustiques pour l’analyse du microbiome au niveau des organes

Apprenez à appauvrir l'ARN ribosomique dans les échantillons d'intestin de moustique pour enrichir l'ARN messager et améliorer l'analyse RNA-seq. Cette méthode atteint 90-99% de déplétion.

L'appauvrissement de l'ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

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