Un test visuel pour surveiller T6SS à médiation bactérienne concurrence

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer la capacité de deux espèces bactériennes à rivaliser l’une avec l’autre lorsqu’elles prospèrent dans la même niche. En particulier, nous évaluerons le rôle du système de sécrétion de type six ou de type six dans ce processus de compétition. Ceci est réalisé en préparant des plaques d’entrée de test avec des cellules de donneur avec un type six actif ou des cellules de proie, qui deviendront des plaques bleues à l’échelle OnX.

Ensuite, des plaques de sortie de test sont préparées sur lesquelles les souches donneuses et éloges sont combinées. Ensuite, les plaques sont incubées pour permettre à l’activité de type six de se produire. Ensuite, la dilution en série est préparée à partir des plaques d’entrée et de sortie, et les cultures diluées sont repérées sur les plaques d’entrée et de sortie de lecture.

On obtient des résultats qui montrent des différences dans la dominance de la couleur bleue à chaque endroit sur la base d’une simple observation visuelle indiquant la survie des cellules de proie dans chaque cas. Plus il y a de bleu, plus la survie des proies est élevée et donc une faible activité de destruction des cellules donneuses. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le comptage des unités formant des colonies, est qu’elle est facile et ne prend pas de temps et permet une évaluation directe de l’activité de type six contre une proie donnée.

Cette technique évalue donc l’activité du sceau bactérien dans des cultures mixtes et peut donc aider à comprendre pourquoi certaines infections polymicrobiennes chroniques finissent par être dominées par une seule espèce bactérienne, comme c’est le cas avec le tibia pseudomona dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Pour commencer, des cellules donneuses macroscopiques de pseudomonas aerogen de type six actives D positives ou de type six inactives D négatives sur des plaques de gélose LB ou LBA pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Dans l’exemple présenté ici, nous avons utilisé une souche RET S de pseudomonas aerogène, possédant un H one de type six constitutivement actif, et un mutant isogénique avec une délétion de l’ingénieur du groupe de gènes H un de type six, une cellule réceptrice d’E coli ou une proie en transformant DH cinq alpha avec un plasmide, permettant la complémentation alpha du gène manquant.

Isolez la bactérie à partir d’un stock de glycérol sur LB avec XGL et un antibiotique approprié et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Sélectionnez et cueillez des transformants bleus et préparez une culture de nuit dans cinq millilitres de tryptyques de bouillon de soja ou de TSB avec antibiotique cultiver sous agitation à 37 degrés Celsius pour l’expérience du lendemain Préparez des plaques LBA étiquetées comme entrée de test pour les souches, D positif, D, négatif et P et sortie de test pour D négatif plus P et D positif plus P.Pour chaque culture cellulaire d’entrée, mesurer la densité optique et calculer le volume nécessaire pour obtenir une densité de cellule équivalente à une unité OD 600. Prélever chaque culture dans un microtube stérile de 1,5 millilitre.

Après avoir testé les échantillons bactériens à 13 000 tr/min pendant une minute et Resus en suspension les granulés dans 100 microlitres de TSB frais, inoculez 10 microlitres de chaque souche en un seul point sur la plaque d’entrée A. Ensuite, mélangez doucement 30 microlitres de D positif avec 30 microlitres de P et dans un deuxième tube, 30 microlitres de D négatif avec 30 microlitres de P. Ensuite, inoculez la sortie A de la plaque avec un point de 20 microlitres de chaque mélange. Après avoir laissé sécher les taches près de l’abus et du brûleur, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pour permettre à la destruction bactérienne d’avoir lieu.

Pour analyser les performances de destruction bactérienne, préparez des plaques LBA contenant 40 microgrammes par millilitre de xal. Pour la lecture du test, étiquetez l’entrée de lecture des plaques pour repérer les bactéries isolées ou la sortie pour repérer les cultures bactériennes mixtes à l’arrière de chaque plaque divisée en quatre parties égales, et étiquetez la section zéro 10 à la puissance moins un, 10 à la puissance moins deux et 10 à la puissance moins trois. Chaque dilution permettra une évaluation semi-quantitative du rapport entre les bactéries bleu-blanc au même endroit.

À l’aide d’une boucle stérile, collectez les taches bactériennes individuelles de la plaque d’entrée A et de la plaque de sortie A et suspendez chaque point dans des microtubes séparés de 1,5 millilitre contenant un millilitre de TSB. Agitez les tubes pendant 30 minutes pour remettre les bactéries en suspension pendant que les cultures tremblent. Préparez cinq ensembles de trois microtubes contenant chacun 900 microlitres de TSB.

Ensuite, en commençant par chaque point remis en suspension, préparez des dilutions en série dix fois plus importantes à l’aide d’embouts frais et en tourbillonnant brièvement entre les points de dilution chaque dilution sur des plaques xal LVA, en commençant par l’échantillon le plus dilué et en terminant par l’échantillon non dilué. Le placage des tubes d’entrée A sur les plaques d’entrée R et la dilution de sortie A sur les plaques de sortie R par point de reproductibilité de 20 microlitres en triple dans chaque quadrant. Pour quantifier l’essai du concours à ce stade, il suffit d’utiliser une plaque de 100 microlitres de dilutions de 10 à moins trois dilutions à partir de la sortie A, d’échantillons en trois exemplaires sur des plaques LBA xga, d’incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et de compter les colonies bleues dans une zone stérile, de laisser les plaques ouvertes pour permettre à l’excès de liquide d’absorber et à l’incubateur de gagner pendant la nuit à 37 degrés Celsius. à ce moment-là, il y a encore des meurtres.

Comme les deux souches sont toujours en contact pour l’analyse de sortie de l’image ou le balayage des plaques. Les taches qui restent largement bleues indiquent que e coli n’a pas été tué. Comme c’est généralement le cas lorsqu’on cultive avec la souche posis défectueuse de type six illustrée, voici une dilution en série pour les plaques d’entrée de lecture pour les souches utilisées dans cet essai.

Comme prévu, les pré-taches P sur l’expression du gène manquant apparaissent en bleu sur les milieux supplémentés en XGL, tandis que les souches D positives de type six actives et D négatives de type six inactives restent blanches. Les plaques de sortie sur lesquelles le mélange entre la proie et une souche active de type six D positive P a été repéré montrent la disparition de la proie bleue, indiquant ainsi qu’elle a été tuée. Cela démontre la capacité du donateur à surpasser la proie.

La persistance de la couleur bleue sur la plaque D négatif P démontre l’incapacité d’un donneur de type six inactif à tuer la proie bleue. Ainsi, lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les exigences pour la croissance ou pour l’activité de sécrétion de type six peuvent varier d’une espèce bactérienne à une autre, et qu’il peut donc être nécessaire d’ajuster un peu le dispositif expérimental. De plus, vous devez également vous rappeler que vous, si vous voulez évaluer l’activité de sécrétion de type six chez une seule espèce, il est également très important de comparer strictement l’activité d’un mutant de sécrétion de type six avec la souche parentale chaque fois que cela est possible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon de mettre en place un essai visuel pour évaluer la survie des précellules après avoir été en contact avec la souche compétente de type six ou une souche défectueuse de type six.