Name: Un test visuel pour surveiller T6SS à médiation bactérienne concurrence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez un test visuel pour surveiller la concurrence bactérienne médiée par le système de sécrétion de type VI chez Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode simple évalue la survie des cellules cibles Escherichia coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le Wellcome Trust WT091939MA subvention. Alain Filloux est soutenue par la Royal Society.

1. Souches bactériennes et les cultures <ol><li> Ingénieur une cellule d&#39;Escherichia coli destinataire (Prey, P) par la transformation (en utilisant la norme de CaCl2 traitement ou électroporation) 15 E. coli DH5a cellules avec un plasmide permettant la complémentation d&#39;une-du gène lacZ (tableau 1). Plaque les cellules transformées sur des plaques d&#39;agar Luria-Bertani (LBA, l&#39;agar 1,5%) contenant du 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) à 40 mg / ml de concentration finale et un antibiotique approprié. Incuber à 37 ° C pendant la nuit et le lendemain matin sélectionner les transformants bleu (voir § 1.3). </li><li> Cultiver les cellules de Pseudomonas aeruginosa donateurs qui sont T6SS-actif (D +) ou T6SS-inactive (D-) (tableau 1) toute la nuit LBA à 37 ° C. Dans l&#39;exemple présenté ici, nous avons utilisé un P. TER aeruginosa souche possédantun H1-T6SS constitutivement active 16 et un mutant isogénique avec une délétion du gène H1-grappe T6SS (tableau 1). </li><li> Le lendemain, préparer une culture de nuit de liquide dans un flacon aéré par inoculation d&#39;un clone bleu vif parmi les E. transformants coli (P) de la plaque décrite au § 1.1, dans 5 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) additionné de l&#39;antibiotique approprié. Croître sous agitation à 37 ° C. Procéder également avec une seule colonie de (D +) et de (D -) de la plaque décrite au § 1.2. </li></ol> 2. Test de compétition <ol><li> Préparer les plaques LBA pour l&#39;expérience lendemain. Assurez-vous que ces plaques sont correctement séché (soit près du brûleur Bunsen ou hotte à flux laminaire). Préparez un &quot;test d&#39;entrée&quot; (A-Entrée) plaque pour les souches (D +), (D -) et (P </strong&gt;). Préparez un &quot;test-output&quot; (A-sortie) pour les souches plaque (D - + P) et (D + + P). Diviser pour marquer les plaques en conséquence. </li><li> Après une croissance de nuit (voir § 1.3), mesurer la densité optique (DO 600 nm) de la culture bactérienne d&#39;entrée (D - D + et P) et calculer le volume nécessaire pour obtenir une densité cellulaire équivalent à 1 unité de DO 600 nm de chaque souche . Chaque culture &quot;input&quot; cellule (D - D + et P) est d&#39;abord recueillie dans un 1.5 stériles tubes Eppendorf ml. </li><li> Centrifuger les échantillons bactériens à 13.000 rpm pendant 1 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les culots de la D -, D + cultures, et P, dans 100 ul de frais TSB par pipetage doux et inoculer 10 ml de chaque cordant souche comme un seul point sur la &quot;A-entrée&quot; plaque (préparé au § 2.1). </li><li> Inoculer le &quot;A-sortie&quot; plaque (préparé au § 2.1). Plus précisément, mélanger doucement 30 ul de (D +) avec 30 pi (P) et 30 ul de (D -) avec 30 ml (P) dans deux tubes Eppendorf distinctes (notez que les cultures utilisées sont celles décrites au § 2.4) . Inoculer 20 ul du mélange (D + / P) et (D - / P) sous forme de points individuels sur la &quot;A-sortie&quot; plaque. Laisser sécher les gouttes à proximité d&#39;un bec Bunsen et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant une période de temps appropriée au cours de laquelle l&#39;effet bactéricide est en cours. Dans le cas de P. aeruginosa, une mise à mort efficaces bactérienne n&#39;est observée après 5 heures d&#39;incubation lorsque l&#39;on compare un T6SS actifs avec une souche T6SS défectueux. </li></ol> 3. Observation qualitative de til bactéricide <ol><li> Préparer les plaques LBA contenant 40 ug / ml de X-gal pour la lecture de l&#39;essai. Les plaques seront appelés &quot;entrée Lecture&quot; ou &quot;entrée R&quot; pour repérer les bactéries isolées ou les &quot;Lecture&quot; ou &quot;R-sortie&quot; pour repérer cultures mixtes de bactéries et donc lu la performance tuer. Ces plaques doivent également être séché. Diviser la plaque en quatre parties égales sur son dos et annoter ces pièces 0, 10 -1, 10 -2 et 10 -3, désignant les dilutions de culture bactérienne à repérer sur les plaques d&#39;agar (voir § 3.3). La dilution permet une évaluation semi-quantitative du rapport bleu / blanc bactéries dans le même endroit. </li><li> Ramasser à l&#39;aide d&#39;une anse stérile les taches individuelles bactériennes de l&#39;&quot;Une entrée&quot; plaque (voir § 2.4) et &quot;A-sortie&quot; plaque (voir § 2.5) et remettre chaque point dans différents tubes Eppendorf de 1,5 ml contenant 1 ml de TSB. Placez-les dans un bloc agitateur Eppendorf pendant 30 min pour remettre efficacement l&#39;bactéries. </li><li> Préparer une série de 5 fois des tubes Eppendorf 3 contenant 900 ul de TSB et procéder pour chaque tache remis en suspension à dix dilutions allant jusqu&#39;à 10 -3. Assurez-vous de changer les embouts de pipette et de vortex 5 secondes entre chaque étape de dilution. </li><li> Passez à l&#39;repérage de vos dilutions bactériennes préparées au § 3.3 sur les plaques LBA bien séchées contenant 40 ug / ml de X-gal, en commençant par la plus diluée à la suspension non diluée, ce qui rend ces les &quot;R-&quot; plaques d&#39;entrée pour le &quot;A d&#39;intrants et les &quot;points&quot; R-sortie &quot;pour les plaques&quot; A-&quot;points de sortie (figure 2). Vortex brièvement chaque tube avant de procéder à la repérer à maintenir une suspension homogène bactérienne. Pour la reproductibilité des résultats, spot de 20 pi en trois exemplaires au sein d&#39;un quart de cercle (figure 2). La sécheresse relative de votre assiette est important à ce stade car les points doivent rester séparés individuellement sur la plaque et ne glissera pas vers l&#39;autre. Une quantification de l&#39;essai de compétition est également possible à ce stade de l&#39;expérimentation. Après l&#39;étape 3.3, épandage 100 ul de dilution des 10 -3 sur des plaques LBA contenant 40 ug / ml de X-gal. Pour la reproductibilité des résultats, procéder à un placage en trois exemplaires pour chaque point de la &quot;A-sortie&quot; plaque. Placez les plaques de dilution dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit (ce qui correspond à 16 heures d&#39;incubation). Procéder au comptage des colonies bleues (les cellules qui sont restés en vie P). Des résultats typiques obtenus après 5 heures de compétition sont présentés dans la figure 3. </li><li> Laisser la plaque (sans couvercle) ouverte dans une zone stérile pour permettre l&#39;absorption du liquide en excès à l&#39;intérieur de chaque tache. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Pendant ce temps d&#39;incubation, la mort est toujours en cours dans le mélange (D + / P) puisque les deux souches sont toujours en contact. </li><li> Prendre une photoou numériser vos assiettes pour l&#39;analyse de sortie (Figure 2). Où points restent en grande partie bleue indique que E. coli n&#39;a pas été tué par P. aeruginosa. C&#39;est le cas lorsque E. coli est mélangé avec un p-T6SS défectueuse aeruginosa souche (D-) (figure 2, la plaque en bas à droite). </li></ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).</li>
<li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).</li>
<li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).</li>
<li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).</li>
<li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).</li>
<li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis%3A+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?</a> BMC Genomics. 10, 104(2009).</li>
<li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).</li>
<li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526(2006).</li>
<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

La méthode présentée dans cet article permet une observation visuelle de T6SS activité médiée / bactériostatique bactéricide. Le dosage est réalisé sur la surface d&#39;une plaque de gélose. Il a été précédemment montré que le dosage en fonction de meurtre T6SS réalisée avec liquide de culture bactérienne mixte n&#39;est pas efficace, probablement en raison de l&#39;absence d&#39;un contact permanent entre les deux bactéries 8. Le T6SS est censé fonctionner avec un mécanisme semblable à celui utilisé par les bactériophages pour injecter l&#39;ADN dans des 17 cellules cibles. En culture liquide, la structure en forme de tube de l&#39;T6SS peut se casser plus facilement, entre-bactérien de contact peuvent être perdus, et les toxines ne sont pas fournis efficacement. En termes de temps d&#39;incubation, les 5 premières heures de contact que nous décrivons entre la souche donneuse et la proie sont suffisantes pour observer la bactéricidie entre P. aeruginosa et E. coli, comme illustré dans la figure 3 </strong&gt;. Néanmoins, il est conseillé de régler le temps d&#39;incubation en effectuant une cinétique afin d&#39;optimiser les conditions expérimentales. Étant donné que cette méthode est une technique basée sur la couleur, les résultats de sortie peut être compromise par la pigmentation de la souche donneuse. Par exemple, dans le cas de P. aeruginosa, certaines souches produisent des niveaux élevés de pigments colorés tels que pyocyanine et pyoverdine, qui peuvent interférer avec la lecture d&#39;essai, ce qui rend la distinction de la proie relativement difficile. D&#39;autres chromogènes β-galactosidase substrats, tels que le magenta ou le gal gal rouge, peut être utilisé à la place du X-gal (tableau 1). Le test de compétition peut faire usage de gènes rapporteurs autres pour la lecture. Par exemple, le dosage similaire a également été réalisée en utilisant la protéine fluorescente verte marquée proies 12. Notre analyse, tout en n&#39;étant pas quantitative, donne une bonne indicationde l&#39;activité T6SS car elle est basée sur la survie ou la mort d&#39;un journaliste proie. Cette technique présente l&#39;avantage d&#39;être simple et pratique pour évaluer l&#39;activité bactéricide / bactériostatique de T6SSs de toutes les espèces bactériennes. Jusqu&#39;à présent, l&#39;activité de la T6SS a été démontré contre les bactéries Gram-négatives et aucun exemple clair de T6SS sensibles à bactéries Gram-positives a été signalé à ce jour 12. Il est également évident que l&#39;incompatibilité de la culture des différentes espèces bactériennes à tester (par exemple, la croissance de la température, l&#39;oxygénation, les médias spécifiques) doit être pris en considération. Notre test peut également être utilisé pour évaluer laquelle des composants T6SS sont absolument indispensables puisque même les traces d&#39;une toxine sécrétée pourrait être suffisante pour tuer la proie. Même une faible activité des T6SS pourrait alors être clairement détectée par notre analyse par rapport à la procédure standard de test T6SS-dépendante la sécrétion de l&#39;aide blot du surnageant de culture et de l&#39;Ouestanalyse. Cependant, une bonne unité formant colonie (UFC) de comptage est toujours nécessaire pour la quantification précise de cette activité T6SS.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ TER (D +) (T6SS actifs) </td><td> Souche de laboratoire </td><td></td><td> Décrit dans Référence 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ TER Δ S1-T6SS (D -) (T6SS inactifs) </td><td> Cette étude </td><td></td><td> Le groupe H1-T6SS (englobant les gènes PA0070 PA0095 à) a été supprimé par échange allélique suivant la procédure décrite dans la référence 18. Le fragment mutateur a été généré avec l&#39;ensemble d&#39;amorces suivant: Les amorces fragment Up: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, et 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Les amorces de fragments Down: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E. coli DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 A1 fin hsd R17 (r k -, m k +) pho Un soutien E44 λ-thi -1 gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Ce vecteur exprime le peptide β α-galactosidase d&#39;utiliser pour α-complémentation. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Utilisez à 40 pg / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck-chimiques </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (caséine de soja bouillon) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex Agitateur Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Densimètre portable </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> Organiques recherche </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Souches, plasmide, la matière et le réactif utilisé. </td></tr></tbody></table>

un test visuel pour surveiller t6ss à médiation bactérienne concurrence

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Systèmes de sécrétion de type VI (T6SSs) sont des nanomachines moléculaires permettant bactéries Gram-négatives à transporter et injecter des protéines dans une grande variété de cellules cibles 1,2. Le T6SS est composé de 13 éléments de base et présente des similitudes structurelles avec la queue de bactériophages tube 3. Le phage utilise un tube et un dispositif de perforation pour percer l&#39;enveloppe cellulaire des bactéries cibles et injecter l&#39;ADN. Il est proposé que le T6SS est un dispositif bactériophage inversé la création d&#39;un chemin spécifique dans l&#39;enveloppe cellulaire bactérienne à conduire des effecteurs et de toxines à la surface. Le processus pourrait être plus poussée et l&#39;appareil pourrait perforer T6SS autres cellules de la bactérie qui est en contact, donc l&#39;injection des effecteurs dans ces objectifs. Le tube de queue et des parties de dispositif de perforation de la T6SS sont réalisés avec les protéines et Hcp VgrG, respectivement 4,5. La polyvalence de la T6SS a été démontrée par ses études utilisant diverses bactéries pathogènes. Les T6SS Vibrio cholerae peuvent remodeler le cytosquelette des cellules hôtes eucaryotes par injection d&#39;un «évolué» VgrG portant un actine C-terminale de réticulation de domaine 6,7. Un autre exemple frappant a été récemment documentés à l&#39;aide de Pseudomonas aeruginosa qui est capable de cibler et de tuer les bactéries d&#39;une manière T6SS-dépendante, favorisant ainsi la création de bactéries dans des niches microbiennes spécifiques et l&#39;environnement concurrentiel 8,9,10. Dans ce dernier cas, trois T6SS-protéines sécrétées, à savoir Tse1, TSE2 et tse3 ont été identifiés comme les toxines injectées dans les bactéries cibles (figure 1). La cellule donneuse est protégé contre les effets délétères de ces effecteurs par l&#39;intermédiaire d&#39;un mécanisme anti-toxine, médiée par les protéines de l&#39;immunité TSI1, Tsi2 et Tsi3 8,9,10. Cette activité antimicrobienne peut être surveillée en cas T6SS-compétents bactéries sont co-cultivés sur sOlid surfaces en concurrence avec d&#39;autres espèces bactériennes ou avec T6SS-inactifs les bactéries de la même espèce 8,11,12,13. Les données disponibles accent sur une approche numérique pour le test de compétition bactérienne, y compris le comptage CFU temps que dépend en grande partie responsables des antibiotiques. Dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques comme P. aeruginosa, ces méthodes peuvent être inappropriés. En outre, avec l&#39;identification d&#39;environ 200 différents loci T6SS dans plus de 100 génomes bactériens 14, un outil de dépistage pratique est hautement souhaitable. Nous avons développé un test qui est facile à utiliser et nécessite du matériel de laboratoire standard et de réactifs. La méthode propose une technique rapide et qualitative de surveiller l&#39;activité bactéricide dépendant T6SS / bactériostase en utilisant une souche journaliste comme une proie (dans ce cas, Escherichia coli DH5a) permettant une complémentation &#39;du gène lacZ. Dans l&#39;ensemble, cette méthode est graphic et permet l&#39;identification rapide des phénotypes liés T6SS sur des plaques d&#39;agar. Ce protocole expérimental peut être adapté à d&#39;autres souches ou espèces bactériennes en tenant compte des conditions spécifiques, tels que les milieux de croissance, de la température ou du temps de contact.

Des résultats typiques sont présentés dans la figure 1, les souches et les réactifs décrits dans le tableau 1. Les plaques représentées dans cette figure ont été scannés après une nuit d&#39;incubation. Les «Lecture-Input&quot; plaques montrent un modèle de dilution en série pour les souches utilisées dans cet essai. Comme prévu, le E. coli proie points (P) surexprimant le gène lacZ apparaissent en bleu sur des milieux supplémentés avec X-gal, tandis que le P. donateurs aeruginosa (D +, T6SS actif) et (D -, inactif T6SS) restent blancs. Les «Lecture-sortie&quot; plaques sur lesquelles le mélange entre la proie et une souche T6SS actif (D + / P) a été repéré montrent la disparition du bleu proie indiquant ainsi qu&#39;il a été tué. Ceci démontre la capacité du donneur à supplanter la proie. La persistance de la couleur bleue sur le (D - / P) Plaque démontre l&#39;incapacité d&#39;un donneur T6SS inactif pour tuer la proie bleu. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Meurtre de E. coli par T6SS compétents dans P. aeruginosa. P. aeruginosa injecte des toxines dans l&#39;E. cellule cible coli d&#39;une manière T6SS-dépendant (indiqué par la flèche blanche). Deux toxines et Tse1 tse3 (orange et rouge cercles) sont injectés dans le E. périplasme coli et de dégrader le peptidoglycane 9. La toxine TSE2 (cercle jaune) est injecté dans le E. coli cytoplasme et possède une action bactériostatique 8,10. L&#39;action combinée des toxines tue les cellules cibles (l&#39;éclair et le crâne). La survie des cellules cibles peuvent être détectées en surveillant l&#39;activité de la β-galactosidase produite (voir aussi la figure 2). P. uneruginosa est protégé contre l&#39;activité des toxines par les protéines de l&#39;immunité TSI1, Tsi2 et Tsi3 (orange, carrés jaunes et rouges, respectivement) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Figure 2. Essai sur plaque de gélose pour surveiller T6SS dépendant de la bactéricidie Dans cette figure sont représentés sur la partie supérieure des «Lecture-Input&quot; plaques comprenant des dilutions en série du D -., D + et les cellules d&#39;entrée P. Les cellules d&#39;entrée P sont bleues en raison de l&#39;α-complémentation du gène lacZ et donc à des β-galactosidase qui clive X-gal. Dans la partie inférieure est montré les «Lecture-sorties&quot; plaques constituées de dilutions successives du mélange bactérienne entre un actif (D + / P) </strong&gt;, ou un inactif (D - / P), T6SS donneur P. souche E. aeruginosa avec l&#39; coli proie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Quantification de l&#39;assassinat de E. coli par P. aeruginosa après 5 heures d&#39;incubation. Le graphique présente le comptage CFU de E. coli décrite dans l&#39;étape de 3,4. Les résultats présentés ici montrent une différence de 3 fois entre le T6SS + et les T6SS-souches, ce qui suggère que la plupart des meurtres se déroule pendant les 5 premières heures de contact.

Nous décrivons un test qualitatif de surveiller la concurrence bactérienne médiée par le<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emType&gt; sécrétion système VI (T6SS). Le test repose sur la survie / destruction des cellules d&#39;Escherichia coli cibles portant un<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Cette technique est réglable afin d&#39;évaluer l&#39;activité bactéricide / bactériostatique de T6SS-compétents micro-organismes.

Un test visuel pour surveiller T6SS à médiation bactérienne concurrence

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer la capacité de deux espèces bactériennes à rivaliser l’une avec l’autre lorsqu’elles prospèrent dans la même niche. En particulier, nous évaluerons le rôle du système de sécrétion de type six ou de type six dans ce processus de compétition. Ceci est réalisé en préparant des plaques d’entrée de test avec des cellules de donneur avec un type six actif ou des cellules de proie, qui deviendront des plaques bleues à l’échelle OnX.Ensuite, des plaques de sortie de test sont préparées sur lesquelles les souches donneuses et éloges sont combinées. Ensuite, les plaques sont incubées pour permettre à l’activité de type six de se produire. Ensuite, la dilution en série est préparée à partir des plaques d’entrée et de sortie, et les cultures diluées sont repérées sur les plaques d’entrée et de sortie de lecture.On obtient des résultats qui montrent des différences dans la dominance de la couleur bleue à chaque endroit sur la base d’une simple observation visuelle indiquant la survie des cellules de proie dans chaque cas. Plus il y a de bleu, plus la survie des proies est élevée et donc une faible activité de destruction des cellules donneuses. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le comptage des unités formant des colonies, est qu’elle est facile et ne prend pas de temps et permet une évaluation directe de l’activité de type six contre une proie donnée.Cette technique évalue donc l’activité du sceau bactérien dans des cultures mixtes et peut donc aider à comprendre pourquoi certaines infections polymicrobiennes chroniques finissent par être dominées par une seule espèce bactérienne, comme c’est le cas avec le tibia pseudomona dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Pour commencer, des cellules donneuses macroscopiques de pseudomonas aerogen de type six actives D positives ou de type six inactives D négatives sur des plaques de gélose LB ou LBA pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Dans l’exemple présenté ici, nous avons utilisé une souche RET S de pseudomonas aerogène, possédant un H one de type six constitutivement actif, et un mutant isogénique avec une délétion de l’ingénieur du groupe de gènes H un de type six, une cellule réceptrice d’E coli ou une proie en transformant DH cinq alpha avec un plasmide, permettant la complémentation alpha du gène manquant.Isolez la bactérie à partir d’un stock de glycérol sur LB avec XGL et un antibiotique approprié et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Sélectionnez et cueillez des transformants bleus et préparez une culture de nuit dans cinq millilitres de tryptyques de bouillon de soja ou de TSB avec antibiotique cultiver sous agitation à 37 degrés Celsius pour l’expérience du lendemain Préparez des plaques LBA étiquetées comme entrée de test pour les souches, D positif, D, négatif et P et sortie de test pour D négatif plus P et D positif plus P.Pour chaque culture cellulaire d’entrée, mesurer la densité optique et calculer le volume nécessaire pour obtenir une densité de cellule équivalente à une unité OD 600. Prélever chaque culture dans un microtube stérile de 1,5 millilitre.Après avoir testé les échantillons bactériens à 13 000 tr/min pendant une minute et Resus en suspension les granulés dans 100 microlitres de TSB frais, inoculez 10 microlitres de chaque souche en un seul point sur la plaque d’entrée A. Ensuite, mélangez doucement 30 microlitres de D positif avec 30 microlitres de P et dans un deuxième tube, 30 microlitres de D négatif avec 30 microlitres de P. Ensuite, inoculez la sortie A de la plaque avec un point de 20 microlitres de chaque mélange. Après avoir laissé sécher les taches près de l’abus et du brûleur, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pour permettre à la destruction bactérienne d’avoir lieu.Pour analyser les performances de destruction bactérienne, préparez des plaques LBA contenant 40 microgrammes par millilitre de xal. Pour la lecture du test, étiquetez l’entrée de lecture des plaques pour repérer les bactéries isolées ou la sortie pour repérer les cultures bactériennes mixtes à l’arrière de chaque plaque divisée en quatre parties égales, et étiquetez la section zéro 10 à la puissance moins un, 10 à la puissance moins deux et 10 à la puissance moins trois. Chaque dilution permettra une évaluation semi-quantitative du rapport entre les bactéries bleu-blanc au même endroit.À l’aide d’une boucle stérile, collectez les taches bactériennes individuelles de la plaque d’entrée A et de la plaque de sortie A et suspendez chaque point dans des microtubes séparés de 1,5 millilitre contenant un millilitre de TSB. Agitez les tubes pendant 30 minutes pour remettre les bactéries en suspension pendant que les cultures tremblent. Préparez cinq ensembles de trois microtubes contenant chacun 900 microlitres de TSB.Ensuite, en commençant par chaque point remis en suspension, préparez des dilutions en série dix fois plus importantes à l’aide d’embouts frais et en tourbillonnant brièvement entre les points de dilution chaque dilution sur des plaques xal LVA, en commençant par l’échantillon le plus dilué et en terminant par l’échantillon non dilué. Le placage des tubes d’entrée A sur les plaques d’entrée R et la dilution de sortie A sur les plaques de sortie R par point de reproductibilité de 20 microlitres en triple dans chaque quadrant. Pour quantifier l’essai du concours à ce stade, il suffit d’utiliser une plaque de 100 microlitres de dilutions de 10 à moins trois dilutions à partir de la sortie A, d’échantillons en trois exemplaires sur des plaques LBA xga, d’incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et de compter les colonies bleues dans une zone stérile, de laisser les plaques ouvertes pour permettre à l’excès de liquide d’absorber et à l’incubateur de gagner pendant la nuit à 37 degrés Celsius. à ce moment-là, il y a encore des meurtres.Comme les deux souches sont toujours en contact pour l’analyse de sortie de l’image ou le balayage des plaques. Les taches qui restent largement bleues indiquent que e coli n’a pas été tué. Comme c’est généralement le cas lorsqu’on cultive avec la souche posis défectueuse de type six illustrée, voici une dilution en série pour les plaques d’entrée de lecture pour les souches utilisées dans cet essai.Comme prévu, les pré-taches P sur l’expression du gène manquant apparaissent en bleu sur les milieux supplémentés en XGL, tandis que les souches D positives de type six actives et D négatives de type six inactives restent blanches. Les plaques de sortie sur lesquelles le mélange entre la proie et une souche active de type six D positive P a été repéré montrent la disparition de la proie bleue, indiquant ainsi qu’elle a été tuée. Cela démontre la capacité du donateur à surpasser la proie.La persistance de la couleur bleue sur la plaque D négatif P démontre l’incapacité d’un donneur de type six inactif à tuer la proie bleue. Ainsi, lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les exigences pour la croissance ou pour l’activité de sécrétion de type six peuvent varier d’une espèce bactérienne à une autre, et qu’il peut donc être nécessaire d’ajuster un peu le dispositif expérimental. De plus, vous devez également vous rappeler que vous, si vous voulez évaluer l’activité de sécrétion de type six chez une seule espèce, il est également très important de comparer strictement l’activité d’un mutant de sécrétion de type six avec la souche parentale chaque fois que cela est possible.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon de mettre en place un essai visuel pour évaluer la survie des précellules après avoir été en contact avec la souche compétente de type six ou une souche défectueuse de type six.

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Speare, L., et al. Essai de coïncubation pour quantifier les interactions compétitives entre les isolats de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test de co-incubation utilisé pour étudier comment les souches bactériennes se font concurrence dans un environnement partagé. Il est largement utilisé en microbiologie pour identifier les mécanismes, tels que la destruction dépendante ou indépendante du contact, qui sont à l’origine de ces interactions.

Essai de coincubation pour l’étude des interactions compétitives entre souches bactériennes

Source : Perinbam, K., et Siryaporn, A. Un test rapide de virulence bactérienne basé sur l’image, utilisant des amibes. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre une méthode rapide basée sur l’image pour évaluer la virulence bactérienne en incubant des amibes avec des bactéries attachées à la surface ou planctoniques, en appliquant un coussinet d’agarose calcéine-acétoxyméthyl (calcein-AM), et en imageant la fluorescence pour détecter les dommages aux cellules hôtes.

Un test rapide basé sur l’image pour le dépistage de la virulence bactérienne induite par la surface

Cette vidéo présente une méthode basée sur la microscopie à fluorescence pour étudier la compétition bactérienne au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet de mieux comprendre la structure et la fonction des communautés bactériennes.

Essai de co-incubation bactérienne : une technique basée sur la microscopie à fluorescence pour visualiser la compétition bactérienne intraspécifique au niveau de la cellule unique

Cette vidéo présente une technique permettant d’évaluer l’activité bactéricide médiée par le complément des anticorps présents dans le sérum. Cette approche combine du sérum isolé avec des bactéries pathogènes et des protéines de complément exogènes. Lors de l’incubation, les bactéries sont cultivées sur une plaque de gélose et les colonies produites sont quantifiées pour mesurer le titre bactéricide sérique.

Dosage bactéricide sérique de l’activité bactéricide médiée par le complément d’anticorps

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Deux tests de dépistage à haut débit par microscopie des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection à Brucella sont décrits. Le test d’entrée détecte les facteurs de l’hôte nécessaires à l’entrée de Brucella et le test final ceux nécessaires à la réplication intracellulaire. Bien qu’il soit applicable à d’autres approches, le criblage de siRNA dans les cellules HeLa est utilisé pour illustrer les protocoles.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

L’essai d’inhibition différée de la croissance peut être utilisé pour évaluer l’effet de compétition d’un isolat bactérien sur un autre. L’inhibition est quantifiée en mesurant la zone d’élimination autour de l’isolat producteur d’inhibiteurs, ou évaluée qualitativement en déterminant l’étendue visible de l’inhibition.

Croissance différée Essai d&#39;inhibition pour quantifier l&#39;effet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence

Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de  l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

Ce manuscrit décrit une méthode d’utilisation de la microscopie à fluorescence unicellulaire pour visualiser et quantifier la compétition bactérienne en coculture.

Quantification de la concurrence interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire

Découvrez un test visuel pour surveiller la concurrence bactérienne médiée par le système de sécrétion de type VI chez Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode simple évalue la survie des cellules cibles Escherichia coli.

Un test visuel pour surveiller T6SS à médiation bactérienne concurrence

Explorer plus de vidéos