Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133 + Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

L’objectif global de cette procédure est d’établir des cultures cellulaires dérivées de patients à partir de mélanomes malins et d’isoler des cellules souches cancéreuses positives pour le CD 1 33. Ceci est accompli en préparant d’abord des cellules uniques de mélanome primaire à partir d’un tissu tumoral après avoir épuisé les érythrocytes de la pastille cellulaire. Si nécessaire, caractériser la culture cellulaire primaire et appauvrir les fibroblastes.

La dernière étape consiste à effectuer un tri magnétique des cellules de mélanome CD 1 33 positives et CD 1 33 négatives. En fin de compte, cette procédure maximale optimisée est une excellente méthode pour obtenir des populations hautement enrichies et viables de cellules CD 1 33 positives et CD 1 33 négatives. Nous avons d’abord utilisé la technique pour valider les données insco en médecine personnalisée où nous essayons de prédire la réponse médicamenteuse des patients atteints de cancer et pour cela, aucune lignée cellulaire disponible dans le commerce ne peut être utilisée.

Le principal avantage de la technique est que nous avons un accès rapide aux cellules positives de CD 1 33, qui sont des cellules souches cancéreuses présumées dans le mélanome malin. La technique sera présentée par Catherine Davis, une technicienne de laboratoire de mon laboratoire. Transférez le tissu tumoral fraîchement isolé de la chirurgie au laboratoire de culture tissulaire dans du PBS stérile contenant 1 % de pénicilline streptomycine.

Transférez le tissu tumoral dans une boîte de Pétri stérile, aspirez l’excès de solution. Ajoutez ensuite 500 microlitres de mélange de dissociation et coupez la tumeur en petits morceaux de deux à quatre millimètres à l’aide de scalpels stériles frais. Transférez maintenant deux à quatre grammes de tissu tumoral haché dans un tube doux de C maximum contenant cinq millilitres de mélange de dissociation.

Rincez la boîte de Pétri avec un mélange de dissociation supplémentaire de 4,5 millilitres et ajoutez les fragments de tissu restants dans le tube C max doux. Fermez le tube, fixez-le à l’envers sur le manchon de la dissociation et lancez le programme H tumeur zéro un. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sous rotation continue à la vitesse de course la plus élevée.

Fixez maintenant le tube à l’envers sur le manchon de la dissociation et lancez le programme H tumeur zéro deux. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sous une rotation continue à 12 tr/min. Ensuite, exécutez le programme max doux H tumeur zéro trois.

Remettez l’échantillon en suspension et faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres. Si nécessaire, agitez la suspension cellulaire à l’aide d’un embout filtrant stérile jusqu’à ce que la suspension complète soit traversée. Rincez la crépine cellulaire avec cinq millilitres de granules quantiques 2, 6, 3 moyennes, la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 300 G et jetez le surnageant.

Si les palais cellulaires semblent lus en raison d’une grande quantité de particules et de mensonges, les globules rouges comme détaillé dans le protocole de texte d’accompagnement. Re-spin les cellules tumorales en quantique 2, 6, 3 et ensemencer une culture de cellules de passage régulières lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence. Analysez la culture cellulaire primaire phénotypiquement à l’aide d’un microscope.

Ensuite, récoltez une petite quantité de la culture cellulaire primaire pour l’extraction de l’ARN après la synthèse de CD NA et effectuez R-T-P-C-R avec des amorces pour les gènes marqueurs du mélanome néoplasique, des cellules souches et des cellules stroma. Les gènes les plus importants à analyser sont le marqueur des fibroblastes CD 90, le marqueur du mélanome et de la déchirure des mélanocytes, le marqueur des cellules souches cancéreuses CD 1 33, le marqueur des cellules dendritiques matures, le CD 83, et un gène d’entretien comme HPRT ou GAAP dh. Si l’analyse microscopique combinée et R-T-P-C-R a révélé une forte contamination par les fibresblastes de la culture primaire de mélanome, procédez à l’épuisement des fibroblastes à l’aide des anti-fibroblastes, des microbilles et des colonnes LD.

Laver les cellules de confluence à 80 % avec du PBS préchauffé, ajouter la quantité appropriée d’Accutane et incuber jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface de la culture. Récoltez les cellules dans un milieu quantique 2, 6, 3 et transférez-les dans un tube de 50 millilitres. Énumérez les cellules, puis centrifugez le nombre requis de cellules pendant cinq minutes à 300 G et de quatre à huit degrés Celsius.

Aspirer complètement le surnageant et réanimer. Suspendre jusqu’à une fois 10 à la huitième cellules dans un tampon de 350 microlitres maximum, ajouter 100 microlitres de réactif bloquant FCR et 50 microlitres CD 1 33. Une biotine.

Bien mélanger et incuber à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Laver les cellules avec un tampon de 10 millilitres maximum, suivi d’une centrifugation pendant cinq minutes à 300 G et de quatre à huit degrés Celsius. Aspirez complètement le surnageant après un deuxième lavage.

Remettre en suspension la pastille de cellule dans 400 microlitres de tampon maximum. Ajoutez 100 microlitres de microbilles anti-biotine et mélangez bien, incubez à quatre à huit degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant ce temps, pour préparer le séparateur max pour la séparation magnétique, fixez le quadro max au support multis séparateur max.

Insérez le nombre requis de colonnes LS avec les ailes de colonne vers l’avant dans le champ magnétique du quadro max. Placez un filtre de séparation primaire dans chaque colonne LS et un tube de collecte approprié. Sous chaque colonne, rincez le filtre et la colonne avec un tampon de trois millilitres maximum et jetez le flux.

Après avoir lavé les cellules dans le tampon max comme décrit précédemment, remettez les cellules en suspension dans un tampon de 500 microlitres maximum et appliquez la suspension cellulaire sur leur colonne LS préparée. Laver trois fois avec un tampon de trois millilitres maximum par colonne. Recueillir l’affluent total de la fraction cellulaire négative cd 1 33 non étiquetée.

Ensuite, jetez le filtre de séparation des prés. Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié. Appliquez un tampon de cinq millilitres maximum.

Rincez immédiatement les cellules positives du CD 1 33 étiquetées en poussant fermement le piston dans la colonne pour augmenter la pureté de la fraction négative. Appliquer la suspension cellulaire sur une nouvelle colonne LS équilibrée et recueillir la fraction négative de l’effluent CD 1 33. Cette métastase ganglionnaire réséquée a été obtenue chez un patient atteint de mélanome à un stade avancé.

Après dissociation mécanique et enzymatique du tissu, la pastille de cellules filtrées contenait une forte contamination par les érythrocytes. Par la suite, l’épuisement des globules rouges a entraîné la formation d’une pastille cellulaire de couleur brun clair. Ces cellules ont été cultivées dans un milieu quantique 2 6 3 ici, un R-T-P-C-R de mélanocytes et de mélanomes, de fibroblastes, de dendritiques et de marqueurs de cellules souches.

Les gènes sont utilisés pour vérifier que les cellules proviennent de la tumeur et non du stroma environnant. Les mélanocytes adultes ont servi de cellules de contrôle normales pour la déchirure et la lignée cellulaire de carcinome embryonnaire N-C-C-I-T comme contrôle positif pour le marqueur de cellules souches CD 1 33. Ces données révèlent que certaines cellules primaires sont effectivement positives pour la déchirure et donc d’origine mélanocytaire.

La culture est également négative pour le CD 83, le marqueur des cellules dendritiques matures. Il est intéressant de noter que cette lignée cellulaire de mélanome exprime le CD 1 33, un gène crucial pour la division cellulaire asymétrique et un marqueur connu des cellules souches cancéreuses. Voici une micrographie à fond clair d’une culture cellulaire primaire fortement contaminée par des fibroblastes après le traitement de la déplétion des fibroblastes, les cultures représentent des cellules primaires de mélanome.

Les cellules primaires du mélanome ont été classées en cellules CD 1 33 positives et CD 1 33 négatives. Ces données issues de l’immunofluorescence, de la coloration et de l’analyse par western blot indiquent une efficacité et une pureté de tri élevées. Cette approche a de grandes implications pour la médecine personnalisée, car nous pouvons désormais utiliser des tissus et des cellules dérivés de patients pour mieux prédire la réponse médicamenteuse de chaque patient individuellement.

Cette méthode nous aidera à répondre à des questions clés telles que : d’où provient la tumeur ? Comment les patients peuvent-ils être traités ? Et cela aidera à mieux redéfinir les approches de biologie des systèmes en validant leurs expériences.