In vitro Organoid Culture des primaires tumeurs du côlon de souris

L’objectif général de cette procédure est d’établir des organoïdes tumoraux neuronaux primaires du côlon. Ceci est accompli en collectant d’abord du tissu tumoral du côlon de souris. La deuxième étape consiste à dissocier l’épithélium normal du côlon adjacent.

Ensuite, les cellules tumorales du côlon sont digérées en cellules uniques. La dernière étape consiste à intégrer des cellules tumorales du côlon dans le matrigel et à les cultiver de manière sélective avec des conditions nutritionnelles limitées. En fin de compte, la microscopie optique est utilisée pour montrer l’évolution temporelle de la formation d’un organoïde de tumeur du côlon.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les lignées cellulaires transformées du cancer du côlon est que les cultures d’organoïdes imitent étroitement l’état in vivo et génèrent des données plus pertinentes sur le plan physiologique. Après avoir euthanasié la souris avec du dioxyde de carbone et recueilli le côlon, rincez le côlon avec du PBS. Utilisez des ciseaux pour ouvrir le côlon longitudinalement, puis placez-le sous un stéréomicroscope et utilisez des ciseaux pour enlever les régions contenant des tumeurs.

Prélevez et lavez le tissu tumoral avec du PBS. Après le lavage, transférez les fragments intestinaux à la chélation EDTA, tamponnez et incubez sur de la glace pendant 60 minutes après la chélation, la plupart des cellules épithéliales intestinales normales seront détachées tandis que les cellules tumorales resteront attachées au méchy. Aspirez le tampon de chélation contenant des cellules épithéliales normales et lavez les fragments tumoraux restants.

Encore une fois. Avec cinq millilitres de tampon de chélation à froid. Après avoir aspiré le tampon de chélation, lavez les fragments de tumeur avec cinq millilitres de XPBS froid.

Après avoir aspiré le XPBS, ajoutez un tampon de digestion aux fragments de tissu et incubez pendant deux heures. À 37 degrés Celsius, laissez les fragments de tumeur se déposer sous une gravité normale pendant une minute, puis collectez le surnageant S dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Granulez la suspension tumorale unicellulaire supinate par centrifugation à 200 fois G pendant trois minutes.

Ensuite, laver une fois avec cinq millilitres de PBS et centrifuger. Encore une fois, gagnez remettre en suspension la pastille tumorale avec 500 microlitres de PBS. Comptez ensuite les cellules tumorales isolées à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, enroulez les cellules tumorales en les centrifugeant à 200 fois G pendant trois minutes et renvoyez cinq milligrammes par millilitre de matrigel sur glace. Ensuite, plaquez 15 000 cellules dans un volume de 50 microlitres de matrigel par puits dans une plaque de 24 puits. Après avoir laissé le mélange de cellules matrigel polymériser pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture basal contenant 50 nanogrammes par millilitre d’urine EGF à chaque puits, changez de milieu de culture basal contenant EGF tous les deux jours et massez les organoïdes un à cinq fois par semaine pour masser.

Après avoir remplacé le milieu de culture par un milieu basal frais, utilisez une pipette P 1000 avec une pointe de pipette coupée pour perturber mécaniquement les organoïdes et le matrigel. Transférez la suspension organoïde dans un tube de faucon de 15 millilitres. Utilisez une pipette à pâtes polie au feu pour perturber davantage les organoïdes.

Laver les organoïdes dissociés avec cinq millilitres de culture basale, le milieu et centrifuger 200 fois G pendant deux minutes. Ensuite, jetez le supinate, remettez la pastille en suspension avec du matri gel et une plaque comme décrit précédemment pour congeler les organoïdes, dissociez-les et centrifugez-les. Comme précédemment, jetez le supinate et le réus.

Suspendre la pastille dans du DMEM contenant 20 % de sérum de veau fœtal et 10 % d’oxyde de diméthylsulf. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques de 1,5 millilitre. Transférez les tubes dans un récipient de congélation Nalgene Mr.Frosty et conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour obtenir un taux de refroidissement de moins un degré Celsius par minute.

Après une nuit d’incubation, transférez les cellules dans de l’azote liquide. Les cellules peuvent être stockées de cette manière pendant plus de deux ans. Pour l’extraction de l’ARN, les cellules sont collectées.

Comme pour le passage, l’ARN est isolé à l’aide du kit d’isolement d’ARN pico pur. Selon les instructions du fabricant pour l’extraction des protéines, la pastille cellulaire est recueillie de la manière habituelle, puis repose dans 100 microlitres de tampon de dosage par radio-immunoprécipitation pour l’immunohistochimie. Après avoir aspiré le milieu de culture cellulaire, utilisez une pipette P 1000 coupée pour transférer les organoïdes tumoraux dans un moule cryogénique.

Placez le moule sur de la glace sèche et ajoutez du fluide de congélation tissulaire au moule, coupez des sections congelées à sept microns et colorez Selon les protocoles précédemment publiés, cette image montre une formation organoïde représentative dérivée d’une tumeur du côlon prélevée sur un enfant de trois mois, une souris PC min, peu de temps après le placage. Cette image montre le même organoïde un jour après le placage. Ici, l’organoïde est en culture depuis trois jours.

Alors que cette image montre l’organoïde six jours après le placage. Ici, deux organoïdes qui ont été cultivés pendant 14 jours sont présentés. Notez qu’à ce stade, chaque organoïde est constitué d’un amas de cellules.

Cet histogramme montre le taux de réussite de la formation d’organoïdes dans deux conditions différentes de digestion de la collagénase. Ces images montrent des organoïdes dérivés d’une tumeur du côlon prélevée sur un enfant de trois mois, une souris PC min avec coloration immunofluorescente pour la bêta-caténine. Le DPI a été utilisé pour colorer les noyaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir l’OID primaire de la tumeur urinaire du côlon par digestion enzymatique.