Vivre imagerie cellulaire de l'autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

L’objectif global de cette procédure est de capturer la formation de trois Auto Phagosomes positifs en conjonction avec des microsomes et des lysosomes. Ceci est accompli en utilisant des cellules T HEC 2 9 3 qui expriment de manière stable GFPD FCP un marqueur A pour les zones oméga et les transectent avec Ccfp lc trois un et marquent les lysosomes avec un traqueur de lyo rouge. La deuxième étape consiste à préparer la chambre d’incubation.

Ensuite, la chambre d’incubation est placée sur la platine du microscope et le milieu riche est remplacé par un milieu de famine pour induire la réponse d’autophagie. La dernière étape consiste à sélectionner les cellules appropriées et à définir les paramètres de la vidéomicroscopie. En fin de compte, l’imagerie de cellules vivantes est utilisée pour montrer que les trois phagosomes positifs lc proviennent des zones oméga positives DFCP un, et qu’ils finissent par fusionner avec les lysosomes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’imagerie à cellules fixes, est que nous pouvons surveiller attentivement la progression des événements dans les mêmes cellules au fil du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’échec de l’APH, telles que la cause des événements menant à la formation de l’objectif. Cette étude utilise une lignée de cellules T HEC 2 9 3 qui exprime de manière stable le marqueur GFPD FCP un A pour les zones oméga, qui sont des structures précurseurs conduisant à la formation d’autophagosomes 48 heures avant l’imagerie de cellules vivantes.

Voir un faible nombre de passage des cellules sur des lamelles rondes de 22 millimètres dans la culture DMEM pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à une co-fluidité de 30 à 40 % le lendemain. Préparation du mélange de complexes de transfection pour chaque plaque contenant un optimal, un milieu sérique réduit extrême G neuf ADN, un réactif de transfection et P-E-C-F-P lc trois ADN plasmatique lc. La troisième est la protéine d’intérêt dont la contribution à la formation des autophagosomes sera analysée dans cette expérience mélangée doucement par pipetage de haut en bas, puis incubée pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, aspirez le milieu des plaques de cellules et ajoutez du DMEM frais préchauffé à 37 degrés Celsius. Ajoutez le complexe de transfection aux cellules et incubez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. 24 heures plus tard, les cellules doivent être confluentes à 80 % et prêtes pour l’imagerie de cellules vivantes si vous utilisez un marqueur d’organite.

Dans l’expérience, prélevez une aliquote de deux millilitres d’un milieu contenant un traqueur de mito ou de traqueur de lyo préalablement préparé et réchauffez-la à 37 degrés Celsius. Dans cette expérience, le traqueur rouge Lyo sera utilisé pour marquer le milieu d’aspiration des lysosomes à partir de cellules transfectées. Remplacez-le par le traqueur lyo contenant le milieu et incubez les cellules pendant 30 à 60 minutes.

Pour commencer cette procédure, nettoyez les joints toriques en métal et en plastique avec de l’éthanol à 75 % et appliquez de la graisse silicone sur le bord du joint torique métallique. À l’aide d’une pince, retirez la lamelle de la plaque et séchez l’excédent de fluide sur la face inférieure de la lamelle. Il s’agit d’éviter de mélanger trop de fluide avec la graisse, ce qui augmentera le risque de fuite.

Laissez reposer le couvercle sur le rebord du joint torique en plastique et fixez le joint torique en métal sur le joint torique en plastique avec le couvercle pris en sandwich entre les deux. Afin de créer une chambre fermée, remplissez la chambre avec le milieu de la plaque À partir de ce moment, évitez l’incubation prolongée des cellules dans un milieu DMEA sans agent tampon pour éviter les changements de pH. Ensuite, placez la chambre d’incubation sur la platine du microscope pour affamer les cellules et induire la réponse d’autophagie.

Aspirez le milieu complet et lavez deux fois avec deux millilitres de milieu de famine. Après le deuxième lavage, ajoutez deux millilitres de milieu de famine frais et réglez la minuterie sur un système d’imagerie approprié configuré pour une épifluorescence à grand champ de cellules vivantes pour cette expérience. Ce système comprendra généralement un cadre de microscope inversé de qualité recherche, une source lumineuse intense à large spectre, des miroirs et des filtres spécifiques pour les protéines fluorescentes ou les colorants d’intérêt, une lentille d’objectif de haute qualité, une caméra sensible C-C-D-S-C-M-O-S et une chambre d’incubation.

Le facteur le plus important est d’utiliser un système de haute sensibilité afin que les niveaux d’expression des rapporteurs fluorescents puissent être réduits au minimum en termes de sélection de cellules appropriées pour l’imagerie de cellules de grande taille et plates permettant de capturer davantage d’événements de formation d’autophagosomes. De plus, sélectionnez les cellules qui ont déjà commencé à produire un plus grand nombre de zones oméga. Utilisez un objectif à fort grossissement pour éviter le photoblanchiment, ajustez l’intensité de la lumière d’excitation à 10 à 20 % du maximum.

Réglez l’appareil photo sur une exposition de 100 à 500 millisecondes, une rotation deux par deux et un gain de 100. Réglez le taux d’acquisition d’image sur une image toutes les 10 secondes. Démarrez la capture vidéo après 30 minutes ou bien dans la réponse d’autophagie afin de capturer un plus grand rapport d’événements de formation d’autophagosomes par vidéo.

Dans cette étude, les cellules exprimant G-F-P-D-F-C-P one et CCF PLC three ont été affamées pendant 30 minutes, puis imagées à raison d’une image toutes les 10 secondes. Cette vidéo montre un événement de formation d’autophagosomes. La vitesse de lecture est de quatre images par seconde.

Un montage de l’événement représentatif de formation des autophagosomes capturé dans la vidéo est montré dans cette figure : les signaux du canal vert indiquant DFCP un sont pseudo colorés en vert et les signaux du canal bleu indiquant lc trois sont pseudo colorés en rouge. La formation d’une zone oméga devient apparente à partir du deuxième cadre sous la forme d’une petite tache indiquée par la flèche. La zone oméga commence à s’étendre afin de former la structure caractéristique en forme d’anneau et atteint son diamètre maximal après environ six minutes.

Ensuite, la zone oméga commence à s’effondrer et finit par disparaître après environ 10 minutes. Lorsque la formation de la structure positive lc trois ou autophagosome est placée dans le contexte de la formation de la zone Omega, il a été observé que l’autophagosome apparaît après la zone oméga et devient clairement visible. Après environ une minute et demie, l’autophagosome commence à s’étendre en association étroite avec la tache de la zone Oméga, puis sonne lorsque la zone oméga commence à s’effondrer, l’autophagosome bourgeonne.

Finalement, l’autophagosome reste en arrière, apparemment pour fusionner avec les lysosomes après la disparition de la zone oméga. Dans cette vidéo suivante, un traqueur de lysosomes indiqué en bleu a été ajouté afin de capturer l’association temporelle et spatiale de l’autophagosome en formation. Avec les lysosomes, la vitesse de lecture est de quatre images par seconde.

La flèche indique d’abord la formation de la zone oméga et deuxièmement, la fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette figure est un montage des événements capturés dans la vidéo comme l’indique la pointe de la flèche. Quelques minutes après l’effondrement de la zone oméga, l’autophagosome naissant commence à s’associer aux lysosomes et finit par fusionner avec un lysosome fusion de l’autophagosome avec le lysosome, éteint en grande partie la fluorescence CFPL C3, probablement en raison de l’exposition de l’étiquette CFP à l’environnement acide du lysosome.

Cependant, le même type d’analyse peut parfois produire des résultats ininterprétables pour diverses raisons. Dans cet exemple, les résultats deviennent ininterprétables en raison d’une dérive de focalisation. Une analyse des images montre que la formation d’un autophagosome est capturée avec succès par vidéo au début.

Cependant, une dérive de la mise au point se produit après la marque des trois minutes. La capture vidéo continue de ne pas être mise au point pendant les six minutes suivantes, mais la mise au point est finalement corrigée manuellement après la marque de neuf à dix minutes. Malheureusement, cette analyse ne permet pas de distinguer si l’événement de formation de l’autophagosome capturé lors de la correction du foyer est l’événement initial qui est presque terminé, ou un nouvel événement qui a commencé après la dérive du foyer.

Pour éviter une dérive de la mise au point, la vidéo doit être surveillée en permanence et des corrections doivent être apportées au besoin, soit manuellement, soit à l’aide de la fonction de mise au point automatique du microscope si disponible. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure par film vidéo si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration d’un microscope pour les applications d’imagerie de cellules vivantes, y compris la formation d’Autophagosome avec des microsomes et des lysosomes.