Name: Lisolement, la culture, et de limagerie de lhomme causés par des amas de cellules pancréatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Apprenez à isoler, cultiver et imager des amas de cellules pancréatiques fœtales humaines pour la recherche sur le diabète. Cette méthode utilise la collagenase et la microscopie à immunofluorescence pour étudier la différenciation cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut pour la médecine régénérative (RB3-02266) et le NIH (DK54441).

Note avant de commencer: <ol><li> Pancréas foetal humain ont été obtenues à partir des anomalies congénitales de laboratoire de recherche, l&#39;Université de Washington (Seattle, Washington, États-Unis) qui a capturé le tissu. Le consentement éclairé au don de tissus, le stockage et l&#39;utilisation des échantillons a été obtenue à partir des bailleurs de fonds par le centre. La déclaration de consentement du protocole a été fournie par écrit et à l&#39;Université de Californie, Programme Human Research Protections San Diego a approuvé l&#39;ensemble de l&#39;étude (Protocole # 081237XT). </li><li> Il est essentiel de maintenir à la fois le pancréas foetal humain et le récipient contenant le pancréas sur de la glace pendant toute la procédure. La dissociation et la digestion doivent être effectuées aussi rapidement que possible. </li><li> Envoyer la clinique où le pancréas foetal humain a été obtenu à partir de la mémoire tampon pour le stockage et le transport du pancréas. (RPMI-1640 + 10% de sérum humain normal (NHS), 300 mM tréhalose SG, pénicilline / streptomycine et fungizone). </li></ol>1. Dissection du fœtus pancréas humain <ol><li> Dissoudre 5 mg de collagénase RT XI dans du HBSS pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg / ml. Filtre stériliser la solution avec un filtre à seringue de 0,22 micron dans un (autoclave) flacon à scintillation stérile et conserver à 4 ° C. Dans une hotte de culture de tissus, figurant deux boîtes de Petri stériles, un petit creuset stérile (si un creuset n&#39;est pas disponible, un petit gobelet peut être substitué), des ciseaux stérilisés, et une pince. Ajouter 2 ml de HBSS à une boîte de Petri à laver le pancréas. Aspirer à partir du liquide dans le tube contenant le pancréas foetales, en laissant environ 1 ml. </li><li> Retirer le pancréas avec une pince dans le 60 mm boîte de Petri sans HBSS. Pour ces expériences, les CCI fœtales sont générés à partir de pancréas frais avec l&#39;âge gestationnel allant de 9 à 23 semaines. Isolement à partir de pancréas à des âges gestionational antérieures est difficile en raison de la taille du pancréas. Le protocole est probablement applicable à l&#39;âge gestationnel au-delà 23 semaines, mais l&#39;acquisition de pancreata après ce temps est difficile à cause de (US) les restrictions fédérales. De temps en temps, le pancréas foetal arrive avec la rate, de la graisse, ou tissu conjonctif joint de la dissection d&#39;origine. Le tissu supplémentaire est facilement visible à l&#39;oeil nu et doit être retiré du pancréas avant de commencer le protocole. </li><li> Rincer le pancréas dans un volume minimal de HBSS froid (~ 0,5 ml) dans la boîte de Pétri. </li><li> Déplacez le pancréas nettoyés au petit creuset stérile à l&#39;aide de pinces stériles et les placer dans un seau à glace. Placer le creuset dans un support pour un tube de centrifugeuse de 50 ml et, en utilisant deux paires de ciseaux, découper le pancréas vigoureusement pendant plusieurs minutes. (Habituellement 2-5 min, mais le temps dépend de la taille et de la fermeté du tissu). Technique de coupe est important. Tenir un côté de la paire de ciseaux dans une position fixe de n&#39;utiliser que les poignées opposées. Les pointes des ciseaux doivent reposer sur le fond du creuset. Continuer avec le mouvement de ciseaux rapide à briser le pancréas en petitmorceaux. Le plus petit des morceaux de tissu, plus la collagénase va fonctionner. </li><li> Ajouter 1,5 ml de + pancréas hachés HBSS dans le flacon contenant la collagénase et placer dans un shaker set de bain d&#39;eau à 37 ° C à 200 tpm pour un maximum de 10 min. Ne cochez pas plus d&#39;une fois pendant les 5 premières minutes. temps de digestion dépend de la qualité du tissu, aussi peu que six minutes peut suffire. Le point final est lorsque les particules sont petites et uniformes. </li><li> Remplir le flacon (10-15 ml) avec du HBSS froide pour arrêter l&#39;activité de la collagénase. Placez sur la glace et permettre aux touffes de s&#39;installer pour 10 min. Souvent, à ce stade, certains la mort cellulaire a eu lieu et l&#39;ADN est libéré dans les médias. Cela peut rendre les médias «filandreuse»; dans ce cas, ajouter 100 ul DNase (10 mg / stock ml) à la solution. </li><li> Après le tissu dans le flacon de scintillation a réglé pendant 10 minutes, aspirer la couche supérieure en laissant un peu moins de la moitié plein (7-8 ml). Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, Ajouter 5 ml de HBSS. Centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g. </li><li> Aspirer le HBSS et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu contenant RPMI-1640, glutamax, 10% de sérum humain normal (NHS), HEPES 10 mM pH 7,2, pénicilline / streptomycine et fungizone. Plaque sur 60 mm boîte de Petri. Pour les chercheurs qui tentent de générer des cellules β, ajouter HGF (10 ng / ml final) pour les médias. En outre, un certain nombre de groupes ont montré que la supplémentation du milieu de culture avec l&#39;hormone incrétine GLP-1 augmente également les cellules β 28. Les cellules doivent être laissés en suspension pendant 72 heures à s&#39;agréger et former des CCI. </li><li> Après 72 h en suspension, les cellules peuvent être ensemencées sur la matrice de la matrice de HTB9 de lignée cellulaire humaine comme décrit précédemment 29. Indépendamment des conditions de croissance, les médias doivent être changés tous les 48 heures. </li></ol> 2. Immunofluorescence de marqueurs de endocrinien prolifération cellulaire et la maturation dans les CCI cultivées en suspension, monocouche, ou sur verre Lamelles de <ol><li> Pour mesurer la prolifération cellulaire, soit de marquage BrdU des cellules adhérentes ou des cellules en suspension est effectuée pendant 12 heures avant fixation PFA. réactif de BrdU est diluée à 1:100 et stérilisé par filtration dans du RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, HEPES 10 mM pH 7,0, pénicilline / streptomycine et fungizone. </li><li> Pour les cellules en suspension: Centrifuger pendant 5 minutes à 300 g et milieu de culture d&#39;aspiration. Ajouter 10 ml de PBS pour laver les CCI, centrifugeuse pendant 5 min à 300 g et aspirer. Si les CCI vont être inclus dans la paraffine, s&#39;il vous plaît suivez protocole facultatif 03.01 à 03.17 pour les cellules adhérentes. Supprimer milieu de culture et laver les cellules avec du PBS comme décrit ci-dessus. Fixer les cellules pendant 20 min à 4% PFA à température ambiante, puis laver deux fois avec PBS. A ce moment, les plaques peuvent être enveloppés avec du Parafilm et stockées dans du PBS à 4 ° C pendant 1 semaine. </li><li> Incuber les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules deux fois avec du PBS et appliquer tampon de blocage (2% fairenkey sérum, 2% d&#39;albumine de sérum bovin, 50 mM de glycine dilué dans du PBS) pendant 1 heure. Laver les cellules avec du tampon de travail (tampon de blocage dilué 1:10). Diluer l&#39;anticorps dans un tampon de travail. Pour les cellules cultivées sur des lamelles de verre, diluer l&#39;anticorps dans 60 ul de volume total. Pour les cellules dans un plat à 6 puits, diluer l&#39;anticorps dans 600 ul volume total. Pour colorer des epitopes multiples, un cocktail d&#39;anticorps peut être appliqué. En tant que témoin, utiliser IgG ou pré sérum immun à la place de l&#39;anticorps spécifique. Les échantillons de contrôle doivent être mises en incubation avec IgG témoin de la même espèce que l&#39;anticorps primaire utilisé. </li><li> Incuber l&#39;anticorps primaire soit 1,5 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Aspirer l&#39;anticorps primaire et laver 3 fois avec le tampon de travail à la température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire à 1:200 d&#39;anticorps conjugués rhodamine et FITC, 1:500 - 1:1000 pour les anticorps conjugués Alexa. Il est important de noter que tous les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Couvrir les échantillonsdans du papier d&#39;aluminium pour éviter une perte de signal. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. FACULTATIF: Pour visualiser les noyaux, DAPI peut être ajouté à 1:500 pendant l&#39;incubation secondaire. Ceci est utile pour la quantification de l&#39;expression des protéines dans la population cellulaire totale. </li><li> Aspirer l&#39;anticorps secondaire et laver 3 fois avec le tampon de travail à la température ambiante. Pour les cellules cultivées sur une lamelle, soulevez doucement la lamelle avec une pince en immersion totale dans la mémoire tampon; laver par immersion dans du PBS. Pour les cellules cultivées dans une plaque à 6 puits, ajouter PBS à laver et aspirer. À ce stade, ils sont prêts à examiner sous un microscope inversé. </li><li> Appuyez sur le bord de la lamelle doucement sur un Kimwipe de se débarrasser de l&#39;excès de PBS. Ajouter une goutte de gel de montage sur une lame de verre et inverser la lamelle couvre-objet sur la lame. Retirer le gel de montage excès par aspiration. Appuyez sur la lamelle doucement avec le dos d&#39;une pointe de pipette 200 ul pour éliminer les bulles. </li><li> Sec à température ambiante pendant environ 20 min ou O / N à 4 ° C et examiner sous un fluo ou microscope confocal. </li></ol> 3. (Facultatif) immunofluorescence des protéines de paraffine CCI embarqués <ol><li> Préparer une solution d&#39;agarose à 3% et laisser refroidir à 55-60 ° C. </li><li> Transférer les CIP incubées en suspension dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 1500 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer les médias à partir des cellules et fixer avec 500 pi 4% PFA pendant 10 min à température ambiante. Ne pas mélanger la pastille, à moins que la pastille est très grande. </li><li> Laver le culot deux fois avec 750 ul de PBS. Comme la PFA à 4%, ce déchet est considéré comme dangereux et doivent être éliminés selon les spécifications de déchets dangereux de votre institution. </li><li> Tapotez doucement le culot cellulaire pour desserrer et ajouter 150-200 pi de l&#39;agarose vers le bas de la paroi du tube de 15 ml conique. </li><li> Mélanger en tapotant doucement le tube, mais ne forment pas de bulles. </li><li> Laisser se solidifier à 4 ° C pendant 5-10 min. </li><li> Utiliser une aiguille de 21 G à délogerle culot et le placer dans un tube de 15 ml conique frais. </li><li> Inclusion dans la paraffine et la préparation de coupes sur des lames peuvent être faites sur place à l&#39;aide d&#39;un microtome ou par vos principales installations de microscopie. </li><li> Déparaffiner tissus, hydrate, et laver avec de l&#39;eau rapidement. </li><li> Ajouter glycine 0,2 M pendant 30 min à température ambiante pour étancher l&#39;aldéhyde restant. </li><li> Laver la lame à deux reprises avec du PBS pendant 2 min chacun. </li><li> Pour la récupération de l&#39;antigène, apporter tampon citrate 10 mM (pH 6,0) à ébullition sur plaque chauffante. Plonger les lames dans le tampon, attendez qu&#39;il revienne à ébullition, et attendre pendant 15 minutes. </li><li> Retirer le bécher de la plaque chauffante. Attendez environ 40 minutes pour les lames refroidir dans le tampon. </li><li> Laver les lames deux fois avec du H 2 O pendant 5 minutes chacun, laver les lames deux fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, bloquer avec 2% de sérum d&#39;âne normal dans du PBS pendant 1 h. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire, dilué à la concentration correcte dans le tampon de travail contenant 0,2% de Triton X-100.En général, l&#39;anticorps primaire est mis à incuber pendant une nuit, si la coloration pour des facteurs de transcription et pendant 1,5 heure si la coloration pour les hormones, les marqueurs de prolifération et / ou différenciation. </li><li> Suivez les étapes 2.3 à 2.9 décrites ci-dessus. </li></ol>

<ol><li>Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+explants+transplanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice.</a> Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).</li>
<li>Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+hormonal+content+of+human+fetal+pancreas+passaged+in+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice.</a> Diabetes. 35, 464-469 (1986).</li>
<li>Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+pancreas%3A+Potential+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Human fetal pancreas: Potential for transplantation.</a> Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).</li>
<li>Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+long-term+cryopreservation+and+transplantation+of+human+fetal+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas.</a> Diabetes. 38, 448-453 (1989).</li>
<li>Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+by+human+fetal+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes by human fetal pancreas.</a> Transplantation. 51, 557-562 (1991).</li>
<li>Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+fetal+pancreas%3A+fresh+vs.+cultured+fetal+islets+or+ICCS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS.</a> J Mol Med. 77, 70-73 (1999).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+pancreatic+insulin-producing+cells+proliferate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro.</a> J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).</li>
<li>Kayali, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SDF-1alpha%2FCXCR4+Axis+is+Required+for+Proliferation+and+Maturation+of+Human+Fetal+Pancreatic+Endocrine+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Otonkoski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+has+insulinotropic+activity+in+human+fetal+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells.</a> Diabetes. 43, 947-953 (1994).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+and+pancreatic+islet+lineage+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).</li>
<li>Shim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+towards+a+pancreatic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate.</a> Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).</li>
<li>Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lees, J. G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+beta-cell+surrogates+guided+by+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny.</a> Regen Med. 1, 327-336 (2006).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+enhances+production+of+insulin+in+insulin-producing+cells+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).</li>
<li>Semb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+endoderm%3A+a+key+step+in+coaxing+human+embryonic+stem+cells+into+transplantable+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells.</a> Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).</li>
<li>Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+endoderm+in+patterned+size-controlled+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters.</a> Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).</li>
<li>Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+fetal+pancreatic+cells+after+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation.</a> Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).</li>
<li>Sandler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+of+human+fetal+pancreas.+Effects+of+nicotinamide+on+insulin+production+and+formation+of+isletlike+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).</li>
<li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).</li>
<li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+is+a+potent+inducer+of+endocrine+differentiation+in+cultured+human+fetal+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.</a> J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).</li>
<li>Xie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+remodeling+mediated+by+polycomb+proteins+orchestrates+pancreatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).</li>
<li>Hardikar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+fetal+porcine+beta-cells+by+glucagon-like+peptide+1+and+cholecystokinin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin.</a> Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).</li>
<li>Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+pancreatic+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).</li>
<li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose%3A+a+cryoprotectant+that+enhances+recovery+and+preserves+function+of+human+pancreatic+islets+after+long-term+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage.</a> Diabetes. 46, 519-523 (1997).</li>
<li>Hayek, A., Beattie, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transplantation+of+human+fetal+and+adult+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).</li>
<li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li>
<li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les méthodes présentées ici permettent de générer un CIP à partir de pancréas foetal humain et par la suite l&#39;image des marqueurs de la prolifération cellulaire et l&#39;endoderme pancréatique. Le processus de dissociation du fœtus pancréas humain nécessaire environ 90 minutes, suivie d&#39;une période de formation de la CCI 72 h, une approche qui est sensiblement différent de protocoles d&#39;isoler des cellules progénitrices des cellules β de souris. Le protocole présenté ici fournit une méthode reproductible qui permet au chercheur d&#39;explorer le développement du pancréas fœtal humain. Deux types d&#39;études longitudinales différentes peuvent être réalisées. En premier lieu, le potentiel de générer des types de cellules pancréatiques fonctionnelles (cellules canalaires, les cellules exocrines et les cellules positives aux hormones) à partir de différents âges gestationnels peut être évaluée après la transplantation. Deuxièmement, les CCI de l&#39;âge gestationnel unique peuvent être mises en culture, traitées avec des agents pharmacologiques sélectionnées et transplantées à différents moments au cours de la culture de la CPI à explorer les différencesdans le destin des cellules. Avec les énormes efforts actuellement réalisés à la différenciation des CSEh en cellules productrices d&#39;insuline, les problèmes liés à la sécrétion d&#39;insuline en réponse à des stimuli physiologiques sont de nouveau relancé. CCI de l&#39;homme fournissent un système de modèle unique d&#39;étudier cet aspect critique de fœtus prolifération des cellules β du pancréas et le développement des cellules. Comme avec n&#39;importe quel protocole pour isoler les cellules des tissus, les détails sont essentiels à la réussite. Un certain nombre de paramètres sont malheureusement en dehors du contrôle du personnel de laboratoire effectuant l&#39;expérience. Deux problèmes rencontrés par ce laboratoire, comme la mauvaise qualité des matériaux de départ et la livraison des tissus non-pancréatique. Tissu pancréatique fœtus sain est ferme pour une coupe de ciseaux. Si les coupes de tissus trop facilement, c&#39;est un signe que les enzymes pancréatiques ont commencé à digérer le pancréas lui-même. De cela, il n&#39;est malheureusement pas la récupération et la préparation est meilleure annulée. Rarement, une danstechnicien expérimenté enlever le pancréas va dérouter sections de l&#39;intestin pour le pancréas. Ces échantillons devront beaucoup plus d&#39;élasticité que le pancréas et une lumière notable seront présents. Encore une fois, ces échantillons doivent être jetés. Lorsque le protocole ci-dessus est suivie comme décrit, il ya rarement des questions qui se posent à jeter l&#39;isolement sur la bonne voie. Quelques points à retenir pour assurer une isolation lisse comprennent, d&#39;utiliser des ciseaux bien aiguisés pour couper du pancréas précis et assurez-vous de ne laisser aucun échantillon de tissu trop gros à digérer. Si les coupes sont pas assez petit, alors la collagénase ne fonctionne pas efficacement, et quelques CCI sont formés. Inversement, lorsque vous utilisez un nouveau lot de collagénase, commencer avec un niveau similaire si UI (unités internationales) pour la digestion que ceux utilisés précédemment. Cependant, diminuer le temps d&#39;incubation pour s&#39;assurer que plus de digestion ne se produit pas. Cette technique de dépannage assure que l&#39;étiquette UI ne varie pas sensiblement d&#39;un lot à batch. Pris en perspective, cette technique d&#39;isolement des CIP fœtaux humains est relativement standard dans le domaine. La plupart des laboratoires ont confirmé nos résultats que l&#39;addition de HGF aux médias aide les cellules survivent et prolifèrent 33. En résumé, nous avons développé une méthode pour isoler CCI fœtales humaines pancréas frais avec l&#39;âge gestationnel allant de 9 à 23 semaines. Les cellules peuvent être cultivées en monocouche ou en suspension pour des expériences de visualiser pancréas endocrine facteurs de transcription et de l&#39;insuline humaine.

Une première limitation à insuline thérapies de remplacement à base de cellules dans le diabète de type 1 est la rareté des îlots humains disponibles pour la transplantation. L&#39;aptitude à réguler la prolifération et la différenciation des cellules précurseurs en cellules pancréatiques humaines productrices d&#39;insuline qui répondent aux besoins métaboliques d&#39;un état d&#39;insulino-déficients reste une composante essentielle pour une thérapie à base de cellules pour traiter le diabète de type 1. Jusqu&#39;à l&#39;avènement de cellules dérivées de CSEh productrices d&#39;insuline, les cellules humaines pancréatiques endocrines du fœtus ou de leurs précurseurs ont été considérées comme des sources potentielles de cellules pour la transplantation clinique. Bien que le paysage scientifique et réglementaire a changé au cours des dernières années, il reste un besoin vital de comprendre comment le pancréas fœtal humain se développe. Beaucoup considèrent maintenant l&#39;utilisation thérapeutique des cellules fœtales humaines comme peu probable, cependant, si les méthodes sûres et efficaces pour développer les cellules ont été établis, l&#39;utilisation thérapeutique de ces cellules pourrait agAin être explorées. Un obstacle majeur qui reste est que la transformation in vitro de cellules pancréatiques fœtales humaines agrégats (CCI) en glucose sensible, sécrétant de l&#39;insuline des cellules endocrines est actuellement un processus inefficace. Bien que beaucoup de travail sur près de 30 ans a élucidé et délimité le profil d&#39;expression des facteurs de transcription nécessaires pour le développement de pancréas endocrine, il reste des lacunes dans nos connaissances sur la façon dont l&#39;expression temporelle des facteurs de transcription est régulée et liée à la fonction des cellules. Jusqu&#39;à l&#39;avènement de cellules dérivées de CSEh productrices d&#39;insuline, les cellules humaines pancréatiques endocrines du fœtus ou de leurs précurseurs ont été considérées comme des sources potentielles de cellules pour la transplantation clinique. Bien que le paysage scientifique et réglementaire a changé au cours des dernières années, il reste un besoin vital de comprendre comment le pancréas fœtal humain se développe. Beaucoup considèrent maintenant l&#39;utilisation thérapeutique des cellules fœtales humaines comme peu probable, mais si efficaceet des méthodes sûres pour développer les cellules ont été établis, l&#39;utilisation thérapeutique de ces cellules pourrait à nouveau être explorée. Un obstacle majeur qui reste est que la transformation in vitro de cellules pancréatiques fœtales humaines agrégats (CCI) en glucose sensible, sécrétant de l&#39;insuline des cellules endocrines est actuellement un processus inefficace. Bien que beaucoup de travail sur près de 30 ans a élucidé et délimité le profil d&#39;expression des facteurs de transcription nécessaires pour le développement de pancréas endocrine, il reste des lacunes dans nos connaissances sur la façon dont l&#39;expression temporelle des facteurs de transcription est régulée et liée à la fonction des cellules. Récemment, le champ de cellules souches a employé les connaissances accumulées au sujet de l&#39;expression temporelle du facteur de transcription au cours du développement des îlots de Langerhans pour entraîner la production de cellules qui expriment les marqueurs de cellules endocrines matures. Bien que la genèse des cellules productrices d&#39;insuline à partir de CSEh et les cellules pluripotentes induites (iPSC) a fait substantielle etdes progrès significatifs au cours des dernières années, les protocoles les plus efficaces nécessitent deux phases de différenciation distinctes: 1) une différenciation in vitro tôt pour générer des cellules exprimant pancréatiques facteurs précurseur de transcription, suivis par 2) maturation in vivo après transplantation - un soi-disant «boîte noire «période. Pour aller de l&#39;avant, les progrès dans la compréhension de la biologie sous-jacente maturation des îlots in vivo, indépendamment de la source de la cellule, doit être compris à un niveau biochimique. La similitude entre les résultats obtenus avec les CCI et les CSEh suggère qu&#39;un certain nombre de processus biochimiques essentiels qui régissent la transition des cellules précurseurs pancréatiques humaines en cellules sécrétrices d&#39;insuline, matures, sensibles glucose in vitro restent inconnus. Un élément central de cette compréhension sera de développer de nouvelles méthodes pour calculer les populations de cellules endocrines fonctionnelles à partir de cellules souches pancréatiques et CSEh, il faudra non seulement env biochimiqueoches qui élucident les événements de maturation, mais des méthodes pour analyser les changements. Pourquoi croyons-nous que l&#39;imagerie des cellules pancréatiques fœtales humaines est un aspect essentiel de détecter les changements dans l&#39;îlot maturation? La réponse se trouve partiellement dans la quête de l&#39;historique pour produire des cellules produisant de l&#39;insuline. Les deux modèles et les systèmes de culture de tissus pour les précurseurs et les îlots pancréatiques ont permis aux chercheurs d&#39;explorer les différences importantes qui existent entre la maturation des îlots d&#39;animaux et d&#39;îlots humains in vitro. Une limitation à l&#39;exploration du développement du pancréas foetal humain est que l&#39;âge gestationnel qui peuvent être légalement utilisés ne donnent lieu à des agrégats de cellules hétérogènes. Bien que les cellules humaines fœtales isolées ressemblent à des îlots, une coloration après culture in vitro à partir de l&#39;âge gestationnel de 9-23 semaines révèle inférieure à 15% contiennent des marqueurs pour les cellules endocrines, avec la plupart des cellules non de coloration pour les hormones de Langerhans. Toutefois, après la transplantation et envivo maturation, la grande majorité des cellules expriment des marqueurs endocriniens 6,25. Les résultats de ces études sont repris aujourd&#39;hui avec les protocoles de différenciation des CSEh qui ne sont en mesure de générer des populations modestes de cellules endocrines positifs d&#39;hormones unique après différenciation in vitro. Méthodes in vitro pour améliorer populations de cellules d&#39;hormones positifs seront probablement donner un aperçu des îlots in vivo maturation. En outre, la compréhension des événements moléculaires qui stimulent le développement du pancréas foetal humain sera probablement redoubler d&#39;efforts pour obtenir des cellules productrices d&#39;insuline à partir de CSEh et délimiter les mécanismes qui régulent la régénération des cellules β et transdifférenciation des cellules du pancréas plus loin. Les similitudes entre les cellules du pancréas foetal humain et CSEh maturation peut être étendu à la fonction des cellules. Comme les cellules murines, les cellules fœtales humaines et des hESC différenciée sont incapables de produire de l&#39;insuline en réponse au glucoseaprès îlot néoformation in vitro 26,27. Cependant, lors de la transplantation dans des souris nude et la maturation, les deux groupes d&#39;îlots comme humains et de cellules produisant de l&#39;insuline provenant de CSEh présentent un phénotype endocrinien. Trois mois après la greffe, près de 90% des cellules transplantées de deux populations sont insuline positif, et fonctionner normalement déterminée par la libération de C-peptide 17,26. Ces résultats indiquent que la transplantation fournit le contexte et non identifiés signaux qui favorisent la maturation des îlots. Protocoles d&#39;imagerie optimisés, tels que celui décrit ici, pour les cellules pancréatiques fœtales humaines aideront dans la recherche pour identifier les facteurs qui modulent et accélèrent la maturation. Exploration biochimique fondamentale des cellules pancréatiques fœtales humaines et CSEh différenciées vers une lignée endocrinien à ce stade de développement est indispensable pour mesurer l&#39;efficacité de la maturation. Le protocole suivant, décrit dans Figure 1, fournit notre procédé actuel pour l&#39;isolement de cellules pancréatiques foetales humaines, appelée CIP à partir de pancréas foetal humain total et l&#39;imagerie de ces cellules. Ce protocole nécessite une préparation initiale de cellules à partir de tissu, qui peut être par la suite cultivées en monocouche ou en suspension. Préparation des cellules pour l&#39;imagerie des marqueurs couramment utilisés endocrine de la prolifération cellulaire et de la maturation est décrite. Génération et l&#39;imagerie des CIP en l&#39;absence ou en présence d&#39;une variété d&#39;agents chimiques modifiant fournit une méthode rapide, par rapport à des modèles de transplantation, pour aider à identifier des conditions de culture et des composés qui accélèrent la maturation des cellules pancréatiques foetales humaines en exocrine entièrement fonctionnel, canalaire, ou hormone produisant des cellules pancréatiques.

<table><tbody><tr><td>Tréhalose SG</td><td>Hayashibara</td><td>Tréhalose SG</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase XI&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C-9407</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec glutamate</td><td>Life Technologies</td><td>11879020</td><td>sans glucose ni HEPES</td></tr><tr><td>Humain AB Sera, Donneurs masculins</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Solution 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes, pH 7.0</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine 100x solution</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des hépatocytes (HGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Peprotech</td><td>130-08</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td> <td>de veau fœtalInvitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles, 60 x 15 mm ; empilables, nervures ventilées</td><td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td><td>D210-13</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>16 % PFA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Life Technologies</td><td>00-0103</td><td></td></tr><tr><td>anti-insuline (souris monclonale ; 1:1 000)</td><td>Sigma</td><td>I2018</td><td></td></tr><tr><td>anti-glucagon (monoclonal de souris ; 1:2 000)</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (monoclonal de souris)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-47910</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (polyclonal de chèvre)</td><td>AbCam</td><td>47383</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (polyclonal de lapin)</td><td>AbCam</td><td>47267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 (lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 (souris)</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (souris)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Lab Vision Neomarkers</td><td>RM 9016-50</td><td></td></tr><tr><td>pan-CK (souris monoclonale ; 1:100)</td><td>Immunotech</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>CK19</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA 2145</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>HTB9 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>5637</td><td>voir Beattie 1997 référence pour générer la matrice</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A-6013</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Depuis presque 30 ans, les scientifiques ont démontré que les CIP fœtales humaines transplantées sous la capsule rénale de souris nude mûri dans le fonctionnement des cellules endocrines, comme en témoigne une augmentation significative de la circulation C-peptide humain suite à une stimulation du glucose 1-9. Toutefois in vitro, la genèse de cellules productrices d&#39;insuline du CCI fœtaux humains est faible 10; résultats rappellent des expériences récentes réalisées avec des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), une source renouvelable de cellules très prometteurs comme traitement thérapeutique potentiel pour le diabète de type 1. Comme les CCI, la transplantation de CSEh différenciées partiellement générer glucose sensible, des cellules produisant de l&#39;insuline, mais dans la genèse vitro de cellules productrices d&#39;insuline à partir de CSEh est beaucoup moins robuste 11-17. Une compréhension complète des facteurs qui influencent la croissance et la différenciation des cellules précurseurs endocriniens exigera probablement des données générées par les deux CCI et ilSC. Si un certain nombre de protocoles existent pour générer des cellules productrices d&#39;insuline à partir de CSEh in vitro 11-22, beaucoup moins existent pour les CCI 10,23,24. Une partie de cette différence vient probablement de la difficulté de travailler avec le pancréas foetal humain. À cette fin, nous avons continué à construire sur les méthodes existantes pour isoler les îlots fœtaux de pancréas humains dont l&#39;âge gestationnel entre 12 et 23 semaines, cultiver les cellules en monocouche ou en suspension, et l&#39;image de la prolifération cellulaire, les marqueurs du pancréas et des hormones humaines y compris le glucagon et C-peptide. CCI généré par le protocole décrit ci-dessous résultat en C-peptide de presse après la transplantation sous la capsule rénale de souris nude qui sont semblables aux taux de peptide C obtenus par la transplantation de tissus frais 6. Bien que les exemples présentés ici se concentrent sur la prolifération de l&#39;endoderme pancréatique et β genèse de cellules, le protocole peut être utilisé pour étudier d&#39;autres aspects du développement pancréatique, Y compris exocrine canalaire, et d&#39;autres cellules produisant des hormones.

Une préparation minutieuse des CIP fœtus est essentielle à la réussite de ce protocole. Images représentatives de la façon dont les cellules semblent généralement à des périodes définies après placage sont présentés dans la figure 2. Après purification, les agrégats de cellules fraîchement plaqué apparaissent comme de petits groupes de clairs rares qui contiennent peu de cellules (figure 2A). Après les 24 premières heures (Figure 2B), un grand nombre des agrégats de cellules deviennent plus grandes, mais de nombreuses petites grappes restent. En 48 heures, les groupes se sont considérablement développées, mais rester asymétrique (figure 2C). À 72 h, les CCI doivent être clairs, relativement uniforme dans la taille et la forme (figure 2D). C'est à ce moment que les cellules peuvent être soit étalées sur des matrices, telles que HTB-9, pendant 24 h avant d'immunofluorescence ou laissées se développer pendant 72 h un autre, en l'absence ou en présence de produits chimiques ou des médicaments qui peuvent altérer l'expression de gènes nécessaire pour pancréatique cellules endocrines generation. Figure 3 met en évidence un certain nombre d'anticorps couramment utilisés pour évaluer soit la prolifération de la CPI ou la différenciation vers endoderme pancréatique. Sur la figure 3A, les CIP ont été plaquées sur HTB-9, cultivées pendant 4 jours, et on les colore pour PDX1, un marqueur critique du développement du pancréas. Bien que la coloration in vitro des CIP est réalisée en routine dans notre laboratoire, le plus souvent, CCI fœtaux humains sont transplantés sous la capsule rénale de souris nude et autorisés à proliférer et se différencier in vivo 6,9,30-32. À des moments précis après la greffe, les souris sont sacrifiées et le rein contenant les CCI transplantés sont enlevés, fixés dans du paraformaldéhyde 4%, et inclus dans la paraffine. 5 um sections séquentielles sont générées directement sur place à l'aide d'un microtome ou par une installation de microscopie à noyau. Épitope démasquage et la coloration des protéines de paraffine tissus pour la microscopie d'immunofluorescence est décrit dans le protocole facultatif 3.10-3.17. Sur la figure 3B, les CIP transplantées ont été colorées avec le marqueur de cellules épithéliales pan cytokératine (PanCK; vert) et avec Ki67 (rouge) pour évaluer la prolifération cellulaire. Dans un autre exemple, à la fois de l'insuline humaine (vert) et le glucagon (rouge) ont été détectés après la transplantation et de la maturation sous la capsule rénale d'une souris nude (Figure 3C). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500"> Figure 1. Diagramme de la préparation de la CPI foetal humain et coloration pour immunofluorescence. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500"> Figure 2. Représentant de préparation CCI fœtale à 0, 24, 48, ou 72 heures après l'étalement (A) CIP.en suspension ont été imagées immédiatement après placage, (B) 24 heures après l'étalement, (C) 48 heures après l'étalement, ou (D) 72 heures après l'étalement. La barre d'échelle pour AC, grossissement 10X = 300 um, barre d'échelle D, 20 grossissement = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg"> .. Figure 3 immunofluorescence des CIP plaqués Régulièrement, les CCI sont imagée pour (A) la PDX1 marqueur de l'endoderme pancréatique (vert), (B) des cellules endocrines (pan-CK; vert) et la prolifération (Ki67, rouge), (C) l'insuline (vert) et le glucagon (rouge). La barre d'échelle pour AC, 40X = 20 um.

Un protocole d&#39;isoler, les grappes de la culture, et de l&#39;image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d&#39;agrégats, et l&#39;image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des amas de cellules pancréatiques fœtales humaines. Ceci est accompli en nettoyant d’abord et en hachant grossièrement le pancréas. Ensuite, le tissu pancréatique est digéré avec de la collagénase.Ensuite, les agrégats digérés sont remis en suspension et plaqués dans des boîtes de Pétri. Enfin, les cellules sont plaquées sur une matrice HTB neuf ou incubées sous forme d’agrégats, et une expérience est réalisée. En fin de compte, R-T-P-C-R.L’analyse de sang Western ou la microscopie d’immunofluorescence sont utilisées pour montrer des changements dans l’expression ou la localisation des gènes ou des protéines. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du diabète de type 1, car un certain nombre de processus biochimiques critiques qui régulent la transition des cellules précurseurs du pancréas humain en cellules matures sécrétant de l’insuline sensibles au glucose in vitro restent inconnus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison d’une digestion incomplète ou excessive qui entraîne une mauvaise formation d’amas de cellules pancréatiques fœtales.La démonstration de cette procédure sera faite par Lopez, un technicien de mon laboratoire, pour commencer à disséquer le pancréas fœtal, aspirer le liquide et transférer le pancréas dans la boîte de 60 millimètres avec des pinces sans HBSS et retirer toute graisse splénique ou tissu conjonctif visible. Utilisez environ un demi-millilitre de HBSS pour rincer le pancréas avant d’utiliser une pince pour le transférer dans un petit creuset stérile et dans un seau à glace. Placez le creuset dans un support pour un tube à centrifuger de 50 millilitres et avec deux paires de ciseaux, tranchez vigoureusement le pancréas pendant plusieurs minutes en tenant un côté des ciseaux dans une position fixe et en ne déplaçant que les poignées opposées tout en posant les pointes des ciseaux sur le fond du creuset à 1,5 millilitres de collagénase et le pancréas haché dans un flacon contenant de la collagénase qui a été préparé.Selon le protocole de texte, placez dans un agitateur à bain-marie réglé à 37 degrés Celsius à 200 tr/min pendant jusqu’à 10 minutes. Ne vérifiez pas plus d’une fois au cours des cinq premières minutes. Le temps de digestion dépend de la qualité des tissus, aussi peu que six minutes peuvent suffire.Le point final est lorsque les particules sont petites et uniformes. Pour arrêter l’activité de la collagénase. Utilisez du HBSS froid pour remplir le flacon, puis placez-le sur de la glace et laissez les grumeaux se déposer pendant 10 minutes.Après l’incubation, aspirez la couche supérieure, la laissant un peu moins qu’à moitié pleine. Si des chaînes d’ADN sont présentes en raison de la mort cellulaire à 100 microlitres de 10 milligrammes par millilitre, de l’ADN dans la solution, puis transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez cinq millilitres de centrifugeuse HBSS pendant cinq minutes à 300 g. Après l’aspiration du HBSS, mettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu contenant du glutamate RPMI 1640, 10 % de sérum humain normal, 10 tas millimolaires, pH 7,2, de la pénicilline streptomycine et une zone fongique.Ensuite, plaquez les cellules dans une boîte de Pétri de 60 millimètres et incubez les cellules en suspension à 37 degrés Celsius pendant 72 heures pour les agréger et former des icc. Après la plaque d’incubation, les cellules de la matrice de la lignée cellulaire humaine HTB neuf, comme décrit précédemment, changent de milieu de croissance toutes les 48 heures pour effectuer une immunofluorescence sur les cellules d’adhérence. Nous retirons le milieu de culture et lavons les cellules avec du PBS.Après avoir lavé les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS, ajoutez 4 % de PFA pour fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante, puis utilisez du PBS pour laver les cellules deux fois. Ensuite, après avoir incubé les cellules avec 0,2 % de tritton X 100 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante et lavé les cellules deux fois avec du PBS, incubez les cellules dans un tampon de blocage pendant une heure, pipetez 60 microlitres de la solution d’anticorps primaire sur du perfil qui a été placé dans un récipient refermable. Retirez ensuite la lamelle de couverture de la plaque à 12 puits et épongez le tampon de blocage supplémentaire avant de le placer sur la goutte d’anticorps primaire.Incuber l’échantillon pendant 90 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les échantillons trois fois, placez une goutte d’anticorps secondaires fluorescents sur un morceau de paraforme avec PBS. Rincez les échantillons et utilisez du papier de soie pour éponger l’excès de PBS avant de le placer sur la goutte de solution d’anticorps.Protégez l’échantillon de la lumière et incubez pendant une heure à température ambiante après avoir lavé les échantillons et tamponné comme précédemment, ajoutez une goutte de gel de montage et retournez la lamelle sur une lame. Utilisez l’aspiration pour éliminer tout excès de gel de montage et le dos d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour tapoter doucement les bulles d’air. Laissez sécher les échantillons pendant 20 minutes et examinez-les au microscope fluorescent ou confocal.Une préparation minutieuse des iccs fœtaux est essentielle au succès du protocole décrit dans cette vidéo. Cette série de panneaux illustre comment les cellules ressemblent généralement à des périodes définies après le placage. Par exemple, après la purification, les agrégats de cellules fraîchement mis en plaque apparaissent sous la forme de petits amas clairs clairsemés qui contiennent peu de cellules.Après les premières 24 heures, de nombreux amas de cellules deviennent plus grands et de nombreux petits amas restent au bout de 48 heures. Les grappes se sont considérablement étendues, mais restent asymétriques à 72 heures. Les iccs doivent être clairs, de taille et de forme relativement uniformes, et peuvent être soit plaqués sur des matrices, soit laissés se développer pendant 72 heures supplémentaires avec ou sans produits chimiques ou médicaments pour générer des cellules endocrines pancréatiques.Ces figures montrent un certain nombre d’anticorps couramment utilisés pour évaluer la prolifération de la CCI ou la différenciation vers l’endoderme pancréatique. Ici, les iccs ont été plaqués sur HTV neuf, cultivés pendant quatre jours et colorés pour PDX un, un marqueur critique du développement pancréatique. Bien que nous effectuions régulièrement des colorations in vitro des iccs, le plus souvent, les icc fœtaux humains sont transplantés sous la capsule rénale de souris nues et autorisés à proliférer et à se différencier in vivo.Dans cet exemple, des coupes de rein incrustées en paraffine contenant des icc transplantés ont été colorées avec le marqueur de cellules épithéliales cytokératine en vert et le KI 67 montré en rouge pour évaluer la prolifération cellulaire. Dans un autre exemple, l’insuline humaine en vert et le glucagon en rouge ont été détectés après la transplantation et la maturation sous la capsule rénale d’une souris nue. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque lot de collagénase diffère et doit être optimisé empiriquement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la culture et l’image. Amas de cellules pancréatiques fœtales humaines.

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Les cellules souches cancéreuses (CSC) ont été identifiées dans un certain nombre de tumeurs malignes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de cytométrie en flux utilisant l'activité aldéhyde déshydrogénase et CD44 et CD24 expression d'isoler les CSC de xénogreffes humaines adénocarcinome pancréatique. Ces cellules viables peuvent ensuite être utilisés dans des études fonctionnelles et analytiques.

Isolement des cellules souches de l&#39;homme xénogreffes de cancer du pancréas

Ici, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une...

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Apprenez à isoler, cultiver et imager des amas de cellules pancréatiques fœtales humaines pour la recherche sur le diabète. Cette méthode utilise la collagenase et la microscopie à immunofluorescence pour étudier la différenciation cellulaire.

L'isolement, la culture, et de l'imagerie de l'homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Explorer plus de vidéos