Les tests pour l'identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et de caractériser de petites molécules antivirales contre le virus de la fièvre catarrhale ovine ou BTV à l’aide du test de viabilité cellulaire basé sur l’EPC. Ceci est accompli en criblant d’abord une bibliothèque de composés antiviraux à l’aide de l’effet cytopathique ou du test basé sur l’EPC avec le réactif de lueur du titre cellulaire. Ensuite, l’efficacité antivirale est confirmée et la cytotoxicité des antiviraux sélectionnés est évaluée à l’aide du test dose-réponse.

Enfin, le test au moment de l’addition est effectué pour déterminer le stade possible du cycle de vie viral des antiviraux sélectionnés, conduisant aux mécanismes d’action possibles. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent de nouveaux antiviraux avec une CIE antivirale puissante et une faible cytotoxicité sur la base du test dose-réponse et du temps du test d’addition. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le dosage TCI D 50 dans un test de plaque est que cette technique fournit une méthode sensible, robuste et hautement reproductrice dans la méthode mesurable pour dépister et catégoriser l’antivirus contre certains virus, y compris le virus du gluten, qui induit une PC mesurable dans les cellules infectées cellules En préparation du test basé sur la CPE à partir de cellules BSR maintenues dans du DMEM supplémenté, utilisez un distributeur de sélection de microflux pour Ensemencez 20 microlitres de cellules à 5 000 cellules par puits dans un 384.

Incuber les cellules pendant deux à trois heures pour leur permettre d’adhérer complètement à la plaque, puis ajouter des composés antiviraux à une concentration finale de 10 micromolaires dans chaque puits et mélanger complètement. Utilisez un milieu de dosage pour diluer la plaque purifiée et propagée du virus de la fièvre catarrhale ovine au titre désiré et ajoutez cinq microlitres de virus de la veine aiguë avec le moment d’inertie indiqué dans chaque puits pour le contrôle. Ajoutez cinq microlitres de milieu de dosage, placez une boîte humide contenant la plaque de test dans l’incubateur et incubez les cellules infectées pendant 72 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 80 à 95 % d’humidité.

Sortez ensuite la plaque de test de l’incubateur, puis décongelez et équilibrez le tampon CTG et le substrat CTG lyophilisé à température ambiante. Reconstituez ensuite la solution homogène de réactif CTG en mélangeant le substrat enzymatique lyophilisé et le réactif tampon selon les instructions du fabricant. Après avoir équilibré les plaques de test à la température ambiante pendant 15 minutes, utilisez un distributeur pour ajouter 25 microlitres de réactifs CTG dans chaque puits, incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité avant d’utiliser un lecteur multimode avec un temps d’intégration de 0,1 seconde pour mesurer les signaux luminescents, ensemencez 5 000 cellules BSR par puits dans une microplaque de 384 puits pour le test dose-réponse en utilisant 20 microlitres pour le test d’efficacité antivirale et 25 microlitres pour le test de cytotoxicité.

Après une incubation de deux à trois heures, répartir huit répétitions pour chaque concentration de composé par essai, comme indiqué ici. Attribuez la première colonne comme témoin positif sans ajouter de composé ou de virus et la dernière colonne comme témoin négatif en ajoutant le virus uniquement pour le test d’efficacité antivirale, diluez les composés à 50 micromolaires dans le milieu de test et ajoutez à la deuxième colonne 20 microlitres par puits. À l’aide d’une pipette semi-automatique à huit canaux.

Mélangez le composé cinq fois jusqu’à une concentration de 25 micromolaires. Ensuite, transférez 20 microlitres du mélange de la deuxième colonne dans la colonne trois et mélangez bien, ce qui donne une concentration de 12,5 micromolaires. Répétez cette opération deux fois.

Dilution en série jusqu’à la 11ème colonne, qui aura une concentration finale de 0,04 micromolaire. Ajoutez ensuite cinq microlitres de milieu à la colonne un en tant que contrôle positif de la cellule uniquement et cinq microlitres par puits de BTV à la colonne 12 en tant qu’infection par le BTV uniquement. Le témoin négatif ajoute cinq microlitres par puits de BTV de la colonne deux à la colonne 11 pour le test de cytotoxicité, dilue le composé à une concentration initiale de 200 micromolaires.

Ajoutez 25 microlitres par puits de composé à la deuxième colonne et mélangez cinq fois pour porter la concentration à 100 micromolaires. Effectuez la dilution en deux séries en transférant 25 microlitres de la colonne deux à la colonne trois voisine et continuez à travers la colonne 12. Après avoir mélangé la colonne 12, aspirez et jetez 25 microlitres du mélange.

La première colonne est le contrôle de la cellule seule pour les tests antiviraux et de cytotoxicité. Mettez une boîte humide contenant la plaque de test dans l’incubateur pendant 72 heures et sortez la plaque par la suite. Utilisez ensuite le kit CT G pour mesurer la viabilité cellulaire.

Utilisez un logiciel biostatistique et graphique pour calculer la valeur moyenne, l’écart-type, les variations de coefficient et le pourcentage de viabilité cellulaire pour chaque composé, concentration et effectuez une analyse de régression non linéaire pour déterminer la CE 50 et la CC 50 de chaque composé. Préparez-vous pour le moment de l’addition ou du dosage TOA en ensemencant 5 000 cellules par puits dans 15 microlitres dans les colonnes un à 24 d’un 384. Bien microplaque pour chaque composé.

Utilisez les 24 colonnes avec huit répétitions pour chaque point temporel. Attribuez la première colonne comme témoin des cellules seulement en ajoutant 10 microlitres par puits de milieu d’essai, marquez la colonne 24 comme une infection par le virus de la fièvre catarrhale ovine seulement. Contrôle négatif par l’ajout de cinq microlitres par puits de milieu de dosage et de cinq microlitres par puits de virus à un moment d’inertie de 0,01.

Dans un volume final de 25 microlitres par puits, sélectionner les colonnes paires de la colonne deux à la colonne 22 comme colonnes d’évaluation de l’efficacité antivirale à différentes heures après l’infection ou l’IPH dans ces colonnes, infecter les cellules avec cinq microlitres par puits de VBT à un moment d’inertie de 0,01 à différents IPH, ajouter également cinq microlitres par puits de composé dilué à un volume final de 25 microlitres par puits pour le moins deux et moins un IPH. Ajouter le composé aux cellules BSR avant l’infection par le virus de la fièvre catarrhale ovine pour un HPI nul, ajouter le composé et le virus de la fièvre catégorique de la veine ovine à la culture simultanément. En parallèle, désignez les colonnes impaires de trois à 23 comme commandes composées uniquement correspondant aux différents points temporels de ces colonnes.

Ajouter cinq microlitres par puits de milieu d’essai et cinq microlitres par puits de composé dilué dans un volume final de 25 microlitres par puits. Après avoir incubé les cellules à 72 HPI dans l’incubateur, retirez la plaque de test et utilisez le kit de lueur du titre cellulaire pour déterminer la viabilité cellulaire. Enfin, utilisez un logiciel qui traite les signaux luminescents obtenus via le lecteur multimode pour déterminer la valeur moyenne.

S-T-D-E-V CV et le pourcentage de viabilité cellulaire de protection pour chaque traitement En utilisant le test CPE pour quantifier la TP cellulaire A dans les cellules vivantes, nous avons précédemment identifié plusieurs composés phares prometteurs avec une efficacité antivirale puissante, une faible toxicité et une sélectivité élevée et élevée. Par exemple, il a été déterminé que le composé 0 5 2 avait une EC 50 de 0,27 plus ou moins 0,12 micromolaire et une CC 50 de 82,69 micromolaires, toutes deux présentant des courbes régressives typiques. Dans le cadre de l’analyse des analyses de régression non linéaire, le SI 50 de C 0 5 2 a été déterminé que 306 sur la base de ses valeurs EC 50 et CC 50, l’efficacité antivirale à l’échelle nanomolaire, la faible toxicité et, par conséquent, un SI 50 élevé indiquaient que C 0 5 2 pourrait être un antiviral puissant et sélectif contre le BTV, comme on le voit ici, les cellules ont été infectées par le virus de la fièvre catarrhale ovine à un moment d’inertie de 0,01 en présence de 10 concentrations différentes de C 0, 5, 2, et la viabilité cellulaire a été déterminée à 72 HPI.

À l’aide du kit CTG, chaque point de données représente les moyennes et l’écart-type de cinq répétitions. Le test TOA a été utilisé pour déterminer les étapes possibles du cycle de vie viral ciblées par les composés. Lorsque le C 0 5 2 a été ajouté une ou deux heures avant l’infection par le BTV, l’efficacité antivirale est restée à l’échelle nanomolaire, comme le montre cette figure.

De plus, la viabilité cellulaire a encore diminué lorsque C 0 5 2 a été ajouté à 32 et 48 HPI, ce qui indique que C 0 5 2 pourrait agir au-delà du stade précoce du cycle de vie viral, comme l’entrée du virus. Étant donné que le premier cycle de réplication virale du BTV est généralement complet dans les cellules infectées à l’intérieur de 24 HPI, nos résultats suggèrent que le C 0 5 2 pourrait agir aux derniers stades du cycle de vie viral du BTV, tels que la réplication du virus, l’emballage, la maturation et la sortie. Pendant ce temps, il est également possible que C 0 5 2 agisse sur la machinerie cellulaire de l’hôte qui fonctionne pendant les stades ultérieurs du cycle de vie viral.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le meilleur essai CPE pour identifier et catégoriser l’antivirus potentiel contre les virus qui induisent un CPE mesurable après l’infection.