Name: Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez l'utilisation de la pHluorine pour étudier la dynamique des récepteurs de guidage axonal en culture cellulaire et dans l'embryon de poussin. Cette méthode permet de visualiser le trafic récepteuriel en temps réel grâce à l'électroporation in ovo.

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Nous remercions Homaira Nawabi, Frederic Moret et Isabelle Sanyas pour leur aide. Ces travaux sont soutenus par le CNRS, Association Française contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA à V.C. ; C.D-B et A.J sont soutenus respectivement par les bourses De la Ligue contre le cancer et du Labex DevWeCan.

1. Stratégie de clonage pour marquer le récepteur PlexinA1 avec pHluorin
<ol><li>Choisissez un vecteur d’expression approprié comme épine dorsale(par exemple, le vecteur exprimant le récepteur de la souris plexineA1, un don gentil du Dr Andreas Puschel11). Remarque: Ce vecteur plexinA1 a été conçu pour réaliser l’insertion efficace de récepteur HA- ou VSV-marqué dans la membrane plasmique.</li>
	<li>Amplifier par PCR la séquence codante de la pHluorine écliptique en utilisant le plasmide adéquat comme modèle(par exemple, le récepteur GABA A marqué par la pHluorine, un don du Dr Jacob2). Si nécessaire, ajoutez un site de restriction à l’extrémité 5' de l’amorce afin de faciliter l’étape de clonage dans l’épine dorsale principale.</li>
	<li>Insérez la séquence pHluorine dans le cadre entre le peptide signal et la séquence codante du récepteur à l’aide de sites de restriction(par exemple les sites de restriction NruI/Kpn2I comme décrit à la figure 1B). Remarque: Parce que le peptide signal qui assure le ciblage correct des récepteurs est clivé, le pHluorin doit être placé après elle. Ceci justifie la reconnaissance du peptide signal et empêche le clivage du pHluorin du récepteur d’intérêt.</li>
	<li>Séquencez les constructions obtenues pour s’assurer qu’aucune mutation n’a été introduite par PCR.</li>
</ol>2. Caractérisation in vitro du récepteur marqué par la pHluorine dans les cellules COS7
La capacité de la protéine de fusion à atteindre la membrane plasmique et sa perte réversible de fluorescence à mesure que le pH est abaissé peuvent être confirmées à l’aide de la procédure suivante.
<ol><li>Jour 1. Plaquez 1,5 x 105 cellules COS7 dans un plat de 35 mm à fond de verre dans 2 ml de milieu Eagle modifié complet de Dulbecco (DMEM - 10 % sérum fœtal bovin - 1 mM de pyruvate de sodium - 25 U/ml pénicilline/stretomycine - 2,5 μg/ml d’amphotéricine B - pH 7,4).</li>
	<li>Jour 2. Cellules transfectées : Remarque: Les cellules doivent être confluentes à 70-80%.<ol>
<li>Préparer 200 μl de NaCl 150 mM et ajouter 3 μg d’ADN, c’est-à-dire le vecteur codant pour le récepteur marqué par la pHluorine. Vortex doucement et tournez brièvement vers le bas. Remarque : Une carte du vecteur pHluorin-plexinA1 utilisé dans ces expériences est illustrée à la figure 1B.</li>
		<li>Ajouter 10 μl de réactif de transfection (ou la quantité appropriée du réactif utilisé). Vortex immédiatement.</li>
		<li>Incuber 10 min à TA.</li>
		<li>Ajouter 200 μl du mélange réactif de transfection/ADN aux cellules.</li>
		<li>Déplacez doucement la plaque pour obtenir le repartition du mélange et replacez les cellules dans l’incubateur à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3. Retirez le milieu de transfection et remplacez-le par 2 ml de DMEM complet frais.</li>
	<li>Jour 4. Effectuer l’imagerie cellulaire en direct des cellules transfectées COS7 pHluorin-plexineA1:<ol>
<li>Préparer deux aliquotes de milieu complet DMEM et ajuster le pH à 3,5 et à 9,5, respectivement. Remarque: Pour une plaque de 35 mm, 1,5 ml de chaque solution est nécessaire pour effectuer l’expérience.</li>
		<li>Retirez le milieu cellulaire et remplacez-le par 1 ml de DMEM complet milieu pH 7,4.</li>
		<li>Préparez une seringue de 5 ml avec un type approprié de tube afin d’injecter divers composants directement dans le milieu de culture cellulaire sans ouvrir la chambre du microscope.</li>
		<li>Utilisez un module qui permet le maintien d’une atmosphère de travail humide à 37 °C, 5 % deCO2. Remarque : Une autre approche de l’utilisation d’une chambre à CO2 consiste à utiliser un milieu tamponné hepes (généralement de l’ordre de 10 à 25 mM selon le type de cellule).</li>
		<li>Placez les cellules dans la chambre et ajustez le tube et la seringue. Remarque : Le microscope doit être équilibré avant de commencer à éviter la dérive mécanique pendant l’enregistrement.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie et sélectionnez le programme d’acquisition multidimensionnel.</li>
		<li>Trouvez des cellules COS7 transfectées avec l’objectif 40X et marquez la position dans le logiciel pour chacune d’elles.</li>
		<li>Configurez la pile Z afin d’avoir une acquisition de profondeur de 15 μm (la mise au point peut changer lors de l’ajout de média dans la plaque).</li>
		<li>Définissez l’exposition pour le filtre GFP et la phase.</li>
		<li>Configurez le calendrier d’acquisition. Note: Pour l’ensemble de l’expérience avec 5 champs d’intérêt, l’acquisition toutes les 20 secondes pendant 10 min devrait être suffisante.</li>
		<li>Commencez l’acquisition et prenez 5 images de contrôle dans un milieu DMEM pH 7,4.</li>
		<li>Suspendre l’acquisition, injecter 1,25 ml de PH 3,5 DMEM complet pour atteindre un pH de 5,5 dans le milieu de culture, marquer l’événement dans le logiciel et reprendre l’acquisition pour 5 points de temps supplémentaires. Remarque: La fluorescence verte devrait progressivement disparaître.</li>
		<li>Suspendre l’acquisition, injecter 1,2 ml de PH 9,5 DMEM complet pour atteindre un pH 7,4 dans le milieu de culture, marquer l’événement dans le logiciel et reprendre l’acquisition pour 5 points de temps supplémentaires. Remarque: La fluorescence verte devrait réapparaître au niveau de la membrane plasmique.</li>
		<li>Analyser les images. La figure 2 montre des images représentatives obtenues avec un tel protocole avec la construction pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In ovo Electroporation de pHluorin-plexinA1 Construire
<ol><li>Manipulation des oeufs avant électroporation:<ol>
<li>Conservez les œufs fécondés au réfrigérateur à 14 °C jusqu’à une semaine avant l’incubation.</li>
		<li>Incuber les œufs à 38,5 °C (101,3 °F) dans un incubateur avec une humidité saturée pendant 50-52 heures jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade HH1412. Remarque: Les œufs doivent être placés horizontalement pendant l’incubation afin que l’embryon soit correctement positionné pour l’électroporation, flottant sur le dessus du jaune. Le stade HH14 convient pour obtenir l’expression des plasmides dans les neurones différenciés de la moelle épinière et dans le ganglion de la racine dorsale avec un taux de survie approprié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embryons électroporates8-10:<ol>
<li>Préparer l’électroporation:<ol>
<li>Préparer des plasmides d’ADN sans endotoxine avec une concentration supérieure à 2 μg/μl, pour pouvoir le diluer comme concentration désirée.</li>
			<li>Tirez suffisamment de capillaires en verre pour injecter les différentes solutions d’ADN.</li>
			<li>Préparer du PBS stérile(-Ca2+;-Mg2+) - 100 U/ml de pénicilline/streptomycine et équilibrer à 38,5 °C.</li>
			<li>Stérilisez le capot, les ciseaux incurvés et les pinces fines.</li>
			<li>Contrôlez l’espacement des électrodes. Remarque: Un espace de 4 mm entre les électrodes est généralement utilisé.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fenêtre de l’œuf13 (figure 3A):<ol>
<li>Utilisez des ciseaux incurvés pour percer la coquille sur le côté émoussé de l’œuf.</li>
			<li>Retirer 2 ml d’albumine à l’aide d’une aiguille de 0,9 mm x 25 mm et d’une seringue de 5 ml. Orientez l’aiguille verticalement afin d’éviter d’endommager le sac vitellin.</li>
			<li>Couvrez le dessus de l’œuf avec du ruban adhésif pour maintenir l’intégrité de la coquille.</li>
			<li>À l’aide de ciseaux incurvés, percez la coquille au milieu du ruban adhésif pour égaliser la pression lors du retrait de 2 ml d’albumine de l’œuf. Ensuite, coupez une fenêtre assez grande pour visualiser l’embryon et pouvoir travailler dessus.</li>
			<li>Ajouter ~2 ml de PBS chaud stérile(-Ca2+;-Mg2+)- 100 U/ml de pénicilline/streptomycine pour éviter la déshydratation de l’embryon et le rendre plus accessible au manipulateur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Injecter de l’ADN et électroporater l’embryon<ol>
<li>Diluer le plasmide dans le PBS(-Ca2+;-Mg2+) à une concentration comprise entre 0,5 et 2 μg/μl et ajouter le colorant vert rapide pour atteindre une concentration finale de 0,025 %. Chargez le mélange d’ADN dans un capillaire. L’utilisation d’un injecteur est recommandée. Remarque : Vérifiez que la résistance capillaire n’est ni trop grande (ce qui signifie qu’il pourrait y avoir des difficultés lors de l’injection d’embryons) ni trop petite (ce qui signifie que le capillaire pourrait être trop gros et pourrait endommager l’embryon). De plus, une concentration d’acides nucléiques supérieure à 2 μg/μl peut causer des effets non spécifiques et doit être contrôlée.</li>
			<li>Percer le sac vitellin et le tube neural du côté caudal avec le capillaire chargé. Entrez dans le tube neural avec un angle peu profond et remplissez la lumière de la queue à la tête avec le mélange d’ADN (Figure 3B). Remarque: Le vert rapide permet de contrôler la précision de l’injection.</li>
			<li>Placez rapidement les électrodes de platine de 4 mm de chaque côté du tube neural au niveau que vous souhaitez électroporater et appliquez 3 impulsions à 31 V pendant 50 ms avec des intervalles de 500 ms(Figure 3C). Remarque : Évitez de placer les électrodes sur le cœur ou sur de gros vaisseaux embryonnaires supplémentaires pour éviter d’endommager l’embryon en développement. Des bulles devraient se former sur les électrodes.</li>
			<li>Avec l’aiguille, retirez 2 ml d’albumen pour diminuer le niveau dans la coquille.</li>
			<li>Scellez la fenêtre et le côté émoussé hermétiquement avec du ruban adhésif.</li>
			<li>Remettez les œufs à 38,5 °C dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade souhaité.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Incorporation et cryosection d’embryons
<ol><li>48 heures après l’électroporation, prélever soigneusement des embryons électroporés (stade HH24). Couper le ruban adhésif et la moitié de la membrane chorioallantoïde. Pour empêcher les embryons de s’enfoncer dans le jaune, placez une passoire sous l’embryon et coupez la seconde moitié de la membrane chorioallantoïde.</li>
	<li>Transférer l’embryon dans une parabole de dissection remplie de PBS glacé.</li>
	<li>Vérifiez l’efficacité de l’électroporation en recherchant la fluorescence dans le tube neural avec un stéréomicroscope à fluorescence. Note : La coélectroporation d’un plasmide témoin codant pour la RFP peut aider à visualiser la zone électroporée.</li>
	<li>Disséquer les embryons à l’aide d’un microscalpel afin de sélectionner la zone électroporée de la moelle épinière.</li>
	<li>Transférer les embryons disséqués sur une plaque de 24 puits et fixer dans un pH de 7,4 4 % de paraformaldéhyde (PFA) - tampon phosphate salin (PBS), O/N à 4 °C. Remarque: L’étape de fixation est cruciale pour permettre la stabilisation de la pHluorine dans sa conformation « vivante » et ainsi pouvoir utiliser la pHluorine dans les tissus fixes / perméabilisés. Bien que la fixation ralentisse considérablement le changement pH-dépendant de la fluorescence, il faut prendre en compte que les changements conformationnels/protonationnels peuvent encore se produire après fixation. Ainsi, le protocole suivant (incorporation, cryosections et observation) doit être réalisé dans les 3 jours suivant l’étape de fixation, avec tous les tampons à pH 7. Si la fixation n’est pas nécessaire, il est recommandé d’effectuer une observation sur les sections de tissus vivants.</li>
	<li>Enlever 4 % de PFA et laver les embryons à un pH de 7,4 PBS.</li>
	<li>Incuber les embryons dans du saccharose PBS-15 % et les conserver à 4 °C jusqu’à ce que les embryons coulent.</li>
	<li>Incuber des embryons fixes dans un pH de 7,4 gélatine à 7,5 % et 15 % de saccharose pendant 45 min à 37 °C afin que les embryons soient complètement incorporés.</li>
	<li>Placez des moules d’encastrement sur de la glace et ajoutez 400 μl de pH 7,4 gélatine à 7,5% et 15% de saccharose pour obtenir une base solide de 2 mm.</li>
	<li>Aspirer l’embryon incorporé avec une pointe coupée et placer l’embryon sur la base de gélatine solide.</li>
	<li>Couvrir avec un pH de 7,4 gélatine à 7,5% et 15% de saccharose et positionner l’embryon avec une pince avant que la gélatine ne se solidifie.</li>
	<li>Une fois que la gélatine est solide, préparez un bain d’isopropanol à -40 °C (utilisez de la glace carbonique ou de l’azote liquide) et congelez le bloc de gélatine pendant 5 min.</li>
	<li>Gardez les blocs congelés à -80 °C.</li>
	<li>Placer le bloc congelé à -20 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Retirez le moule et fixez le bloc sur un mandrin avec un milieu de polyéthylène glycol.</li>
	<li>Une fois que le bloc est bien fixé, placez le mandrin dans le système cryostat. Remarque : Utilisez des lames enrobées pour éviter la perte de tissu pendant la coloration.</li>
	<li>Effectuer des cryosections en série (des cryosections de 20 μm sont habituellement effectuées).</li>
	<li>Laisser sécher les cryosections pendant 15 min à TA. Remarque: des cryosections devraient être protégées contre l’exposition inutile à la lumière afin d’éviter le blanchiment de la fluorescence de GFP.</li>
</ol>5. Analyse microscopique des cryosections
<ol><li>Réhydratez les cryosections dans le pH 7,4 PBS à droite pendant 10 minutes. Remarque: Si nécessaire, les noyaux peuvent être colorés avec Hoechst.</li>
	<li>Utiliser une solution de Hoechst à 0,5 μg/ml dans du PBS et incuber des cryosections pendant 15 min.</li>
	<li>Rincer les lames 3x avec un pH 7,4 PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Passez au montage par glissement. Une solution de montage d’alcool polyvinylique à pH 7,4 (ou plus basique) qui durcit O/N peut être utilisée : positionner soigneusement la lame de couverture pour éviter la formation de bulles d’air entre la lame et la lame de couverture.</li>
	<li>Laisser le milieu de montage durcir O/N à 4 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Utilisez un microscope confocal inversé pour visualiser avec précision la protéine de fusion pHluorin-plexineA1 : effectuez une z-stack à la résolution optimale du trou d’épingle et optique et utilisez des lentilles 20X (NA 0,75) ou 40X (NA 1,3). Remarque : La pHluorine est détectable avec les mêmes paramètres que ceux utilisés pour détecter la GFP(c.-à-d. le pic d’émission à 509 nm). Les paramètres d’excitation et de filtre de détection de longueur d’onde sont définis de manière optimale par le logiciel d’imagerie. Hoechst est détecté entre 425-460 nm (l’excitation est à 405 nm), GFP ou pHluorin est détecté entre 485-545 nm (excitation est à 473 nm) et RFP est détecté entre 575-675 nm (excitation est à 559 nm).</li>
</ol>Des images représentatives de l’expression de la pHluorine-plexineA1 et de l’eGFP dans la moelle épinière de l’embryon de poussin sont illustrées à la figure 4.

<ol><li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li>
<li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comm+function+in+commissural+axon+guidance%3A+cell-autonomous+sorting+of+Robo+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiesenbock%2C+G+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22">Cold Spring Harb. Protoc.</a>. 2012, 213-217 (2012).</li>
<li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), (2007).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+of+miRNA-based+plasmids+in+the+developing+neural+tube+and+assessment+of+phenotypes+by+DiI+injection+in+open-book+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin%2Fneuropilin+complexes+mediate+repulsion+by+the+axonal+guidance+signal+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A.</a> Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn.%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J. Vis. Exp. (8), (2007).</li>
<li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+actin+control+polarized+expression+of+TI-VAMP+vesicles+to+neuronal+growth+cones+and+their+fusion+with+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li>
<li>Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+endosomes%3A+how+many+varieties+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolving endosomes: how many varieties and why.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li>
<li>Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+clathrin-mediated+endocytosis+drives+repulsive+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance.</a> Neuron. 66, 370-377 (2010).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li>
<li>Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+for+synaptojanin+1+in+rod+and+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors.</a> J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).</li>
<li>Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+local+circuits+and+their+implications+for+olfactory+processing+in+the+fly+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe.</a> Cell. 128, 601-612 (2007).</li>
<li>Dittman, J. S., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+regulating+the+abundance+and+localization+of+synaptobrevin+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).</li>
<li>Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neuronal+activity+by+targeted+expression+of+a+genetically+encoded+probe+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse.</a> Neuron. 42, 9-21 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li>
<li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li>
<li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li>
<li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li>
<li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHTomato%2C+a+red%2C+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li>
<li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour suivre la dynamique d’un récepteur de guidage axone à la fois dans la culture cellulaire et dans le contexte développemental de la moelle épinière de l’embryon de poussin.
Pour concevoir une protéine marquée par la pHluorine de novo, deux points doivent être pris en compte concernant la stratégie de clonage. Tout d’abord, la balise de pHluorin devrait être exposée à la lumière des endosomes acides, et par conséquent, au compartim...

Lors de leur navigation, les axones intègrent de multiples indices environnementaux qui les guident vers leur cible. Ces signaux activent les récepteurs de guidage à la surface des bornes axoniques, les cônes de croissance, qui à leur tour initient une voie de signalisation appropriée. Ainsi, la régulation temporelle et spatiale de la distribution de surface cellulaire des récepteurs est essentielle pour définir la sensibilité du cône de croissance1. Dans ce contexte, le croisement de la ligne médiane par les axones commissuraux est un excellent modèle pour étudier la régulation des niveaux de surface des cellules réceptrices. Dans la moelle épinière en développement, les axones commissuraux sont initialement attirés vers la plaque ventrale du plancher où ils traversent la ligne médiane. Après la traversée, ils perdent leur réactivité aux attractifs de la plaque de plancher et gagnent en réponse aux répulsifs de plaque de plancher afin qu’ils puissent sortir de la plaque de plancher et naviguer vers leur destination finale dans le côté controlatéral du système nerveux2,3. La régulation de la disponibilité des récepteurs à la surface du cône de croissance est l’un des mécanismes sous-jacents au changement de réactivité aux signaux médians4,5. Ainsi, la surveillance sélective des récepteurs présents à la membrane plasmique des cônes de croissance est d’une importance primordiale. Nous décrivons ici une méthode basée sur la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour visualiser spécifiquement les récepteurs de guidage axonaux qui sont adressés à la membrane plasmique in vitro et in vivo,dans la moelle épinière de poussin en développement.
Rothman et ses collègues ont conçu par des mutations ponctuelles des variantes sensibles au pH de la GFP, y compris le pHluorin écliptique6. Le pHluorin écliptique a la propriété d’être non fluorescent lorsqu’il est exposé à un pH acide (<6), tout en étant fluorescent à pH neutre. Cela permet de distinguer les récepteurs non fluorescents localisés dans les compartiments acides intracellulaires(c’est-à-dire endosomes, vésicules de trafic) des récepteurs fluorescents incorporés à la membrane plasmique et donc exposés au pH neutre extracellulaire7. Nous en avons profité pour surveiller la localisation de la membrane plasmique de la plexineA1, un récepteur de guidage axone médiant la réponse du cône de croissance à la sémaphorine répulsifique médiane 3B5 (figure 1A). Nous décrivons ici la caractérisation in vitro d’une construction pHluorin-plexinA1, avec l’électroporation8-10 in ovo de cette construction dans la moelle épinière de poussin se développante suivie de l’analyse microscopique des cryosections qui permettent de suivre la dynamique de récepteur de guidage d’axone in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles.

<table><tbody><tr><td>Cellules COS7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>GIBCO</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau</td><td>GIBCO</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Exgen500</td><td>Euromedex Fermentas</td><td>ET0250</td><td></td></tr><tr><td>PBS -Ca2+ -Mg2+</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Colorant vert rapide</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr> Solution <tr><td>aqueuse de paraformaldéhyde à 32 %</td><td>Microscopie électronique</td><td>15714-S</td><td>Diluer extemporanément dans du PBS pour obtenir une solution à 4 %</td></tr><tr><td>Gélatine à partir d’eau froide peau de poisson</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cryomount</td><td>Histolab</td><td>00890</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen</td><td>H21486</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Fluka</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fond en verre 35 mm</td><td>Plat MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-05S</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 0,9 mm x 25 mm</td><td>Terumo</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires</td><td>CML</td><td>PP230PO</td><td>capillaires sont étirés manuellement dans la flamme</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Matériau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td><td>FST</td><td>129-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>FST</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>FST</td><td>Dumont #5 REF#11254</td><td></td></tr><tr><td>Équipement/logiciel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à accéléré</td><td>Zeiss</td><td>Observer 1</td><td></td></tr><tr><td>Module de température S</td><td>PECON pour Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 module S</td><td>PECON pour Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Metamorph</td><td></td> Incubateur d’œufs Metamorph <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sanyo</td><td>MIR154</td><td></td></tr><tr><td>Appareil électroporateur</td><td>Nepa Gene CO., LTD</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes</td><td>Nepa Gene CO., LTD</td><td>CUY611P7-4</td><td>Électrodes en platine de 4 mm</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescence</td><td>LEICA</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>MICROM</td><td>HM550</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000, X81</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Fluoview</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC Logiciel d’établi principal</td><td>CLC Bio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la phluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Au cours du développement, les récepteurs de guidage axonaux jouent un rôle crucial dans la régulation de la sensibilité des axones aux signaux attrayants et répulsifs. En effet, l’activation des récepteurs de guidage est la première étape des mécanismes de signalisation permettant aux pointes axoniques, les cônes de croissance, de répondre aux ligands. En tant que tel, la modulation de leur disponibilité à la surface de la cellule est l’un des mécanismes qui participent à la définition de la sensibilité du cône de croissance. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser avec précision la dynamique de surface spatio-temporelle de cellules d’un récepteur de guidage axone in vitro et in vivo dans la moelle épinière de poussin en développement. Nous avons tiré parti de la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour détecter spécifiquement la fraction du récepteur de guidage axone qui est adressée à la membrane plasmique. Nous décrivons d’abord la validation in vitro de telles constructions pH-dépendantes et nous détaillons plus loin leur utilisation in vivo,dans la moelle épinière de poussin, pour évaluer la dynamique spatio-temporelle du récepteur axon de guidage d’intérêt.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Figure 1. A. Schéma des propriétés de fluorescence de la pHluorine-plexineA1 dans un contexte cellulaire. La pHluorine est non fluorescente dans les compartiments intracellulaires où le pH est acide (<6) comme dans les vésicules en trafic ou dans les endosomes et est fluorescente lorsqu’elle est exposée au m...

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser une variante de la GFP sensible au pH pour étudier la dynamique spatio-temporelle du trafic des récepteurs de guidage axonal à la surface de la cellule. Pour ce faire, on marque d’abord le récepteur d’intérêt avec la séquence de Florin à l’aide d’une stratégie de clonage appropriée. La deuxième étape de la procédure consiste à caractériser la sensibilité au pH du récepteur marqué Florin transfecté in vitro.La troisième étape consiste à électroporer la construction du récepteur marqué par Florin dans l’OVO pour obtenir l’expression dans la moelle épinière. La dernière étape consiste à sectionner les embryons électroporés au stade souhaité. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des changements dans le trafic des récepteurs à la surface de la cellule dans les domaines spatial et temporel grâce à la microscopie à immunofluorescence.L’avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’utilisation de constructions protéiques de technologie GFP, est que la sensibilité au pH des récepteurs à trois ailes du pH permet de détecter des changements spatio-temporels de la dynamique des récepteurs à la surface de la cellule, à la fois in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine du guidage Axon. En effet, cela peut aider à caractériser la régulation spatio-temporelle de la distribution d’une distribution de surface cellulaire d’un récepteur de guidage axonal, et nous savons que la dérégulation est critique pour définir la sensibilité d’un cône grossier à une file d’attente particulière.Cette méthode peut fournir des informations sur le domaine du guidage axonal dans le modèle d’embryon de joue, mais elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les tranches de cerveau de souris. Le maintien de la culture en combinaison avec l’imagerie de la vie a préparé sept cellules dans le DMEM à 70 à 80 % de fluidité et le gène d’intérêt cloné dans le vecteur florin. Commencez par ajouter trois microgrammes d’ADN à 200 microlitres de chlorure de sodium de 150 millimolaires.Tourbillonnez doucement le mélange, puis faites-le tourner brièvement. Ajoutez ensuite la quantité appropriée de réactif de transfection dans ce cas, 10 microlitres et vortex. Laissez immédiatement le mélange reposer pendant 10 minutes.Ajouter la température ambiante. Ensuite, ajoutez 200 microlitres du mélange terminé dans les cellules. Faites tourner doucement la plaque et remettez-la dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 48 heures avec un changement de support comme décrit dans le protocole de texte.Deux jours plus tard, préparez la chambre du microscope. Transférez maintenant les cellules dans la chambre. Connectez-y une seringue de cinq millilitres afin que les composants puissent être ajoutés directement pendant que la chambre est maintenue à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Avant d’utiliser le microscope, assurez-vous qu’il est équilibré pour éviter toute dérive mécanique pendant l’enregistrement. Ensuite, ouvrez le logiciel d’imagerie et sélectionnez le programme d’acquisition multidimensionnelle et trouvez le coût transfecté sept cellules avec la marque d’objectif 40 x chacune de leurs positions dans le logiciel où configurer la pile Z à une profondeur d’acquisition de 15 microns. N’oubliez pas que la mise au point peut changer lors de l’ajout de support dans la chambre d’imagerie.Réglez la phase appropriée, l’exposition au filtre GFP et le bon moment d’acquisition pour une expérience avec cinq champs d’intérêt, faisant l’acquisition d’images toutes les 20 secondes pendant 10 minutes devraient suffire. Démarrez les acquisitions et prenez cinq images de contrôle dans le milieu DMEM pH 7,4. Ensuite, mettez les acquisitions en pause.Injecter 1,25 millilitres de pH 3,5, DMEM complet pour atteindre un pH de 5,5 dans le milieu de culture. Marquez l’événement dans le logiciel et reprenez l’acquisition d’images pour cinq autres points de temps. Pendant ce temps, la fluorescence verte devrait disparaître progressivement.Ensuite, mettez les acquisitions en pause. Injecter 1,2 millilitres de pH 9,5, DMEM complet pour atteindre un pH de 7,4 dans le milieu de culture. Marquez cet événement dans le logiciel et obtenez cinq points de temps supplémentaires.Maintenant, la fluorescence verte devrait réapparaître au niveau de la membrane plasmique. Des détails sur la manipulation des œufs avant l’électroporation et d’autres préparations sont fournis dans le protocole de texte. Cette section commence par la création d’une fenêtre dans l’œuf.Couvrez le haut de l’œuf avec du ruban adhésif à l’endroit où la fenêtre sera faite. Ensuite, à l’aide de ciseaux incurvés, percez la coquille sur son grand côté émoussé. Prélever deux millilitres d’albumine à l’aide d’une aiguille attachée à une seringue de cinq millilitres.Orientez l’aiguille verticalement afin de ne pas endommager le sac de jaune sur le dessus de l’œuf. Faites un autre trou en utilisant le même processus. Ensuite, à partir du deuxième trou, découpez une fenêtre suffisamment grande pour visualiser l’embryon et pouvoir travailler dessus.À environ deux millilitres de PBS stérile, chaud et modifié, cela empêche la déshydratation et augmente l’accessibilité. Injectez maintenant l’ADN et caressez l’embryon. Tout d’abord, diluez le plasmide dans le PBS à une valeur comprise entre 0,5 et deux microgrammes par microlitre, mais pas plus.Ajoutez ensuite un colorant vert rapide à une concentration finale de 0,025 %Chargez le mélange d’ADN dans un capillaire pour injecter l’ADN à l’aide d’un injecteur. Si la résistance du capillaire est trop importante, il pourrait être difficile d’injecter les embryons. Si la résistance est trop faible, la taille du capillaire pourrait endommager l’embryon avec la ponction capillaire chargée, le sac vitellin et le tube neural du côté du dorlot, l’insérer dans le tube neural à un angle peu profond et remplir la lumière de la queue à la tête avec le mélange d’ADN.Ensuite, placez rapidement les électrodes de platine de quatre millimètres de chaque côté du tube neural et électroporatives avec des impulsions de 50 millisecondes et 31 volts toutes les demi-secondes. Des bulles doivent se former sur les électrodes. Évitez le cœur ou les gros vaisseaux embryonnaires supplémentaires.Lorsque l’électroporation est terminée, utilisez une aiguille pour prélever deux millilitres d’albumine. Scellez ensuite hermétiquement la fenêtre et le côté émoussé avec du ruban adhésif. Remettez les œufs à 38,5 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade désiré.Suivez ensuite les procédures d’enrobage et de cryosection données dans le protocole texte, l’utilisation de Florin fournit une résolution spatio-temporelle précise du tri des récepteurs transmembranaires au niveau de la membrane plasmique. Pour la démonstration plex dans un a été étiqueté avec Florin. Il s’agit d’un récepteur de guidage qui médie le signal de se Forin three B.La construction a été exprimée in vitro.Dans le CO sept cellules et l’imagerie de cellules vivantes a été réalisée à un pH physiologique. Le récepteur se trouvait principalement au niveau de la membrane plasmique, confirmant ainsi la détection de la seule surface cellulaire du récepteur. Après électroporation innovo, il a été constaté que le plex dans un se distribue à la surface du cône de croissance lors du croisement de la plaque de sol.Au stade de pré-franchissement, le plex dans un n’a pas été détecté à la surface de la cellule. Cela suggère que la signalisation des axones B de SEMA quatre et trois est limitée à l’étape post-croisement. En tentant cette procédure, il convient de noter que l’utilisation de la grippe pH est principalement adaptée à la surveillance de la préparation de la vie.L’utilisation du pH flu dans les tissus fixés nécessite une attention particulière pendant et après la fixation. Étant donné que la confirmation du pH de la grippe peut n’être que temporaire, le pH de toutes les solutions doit être maintenu au-dessus de sept et l’observation doit être effectuée peu de temps après la fixation après son développement. Cette méthode ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du guidage axonal et de la migration cellulaire pour explorer la régulation de la distribution à la surface cellulaire d’un récepteur de guidage dans différents modèles animaux tels que la célé, contre la drosophile et la souris.

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Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin (Vidéo) | JoVE Journal

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