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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Prélèvement et préparation des embryons et des larves de Drosophila melanogaster

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila melanogaster Embryo and Larva Harvesting and Preparation

3.9: C. elegans Development and Reproduction

3.15: C. elegans Chemotaxis Assay

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08:14 min

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April 30, 2023

Overview

Les embryons et larves de Drosophila melanogaster sont facilement manipulables et se développent rapidement via des mécanismes analogues à ceux d’autres organismes, tels que les mammifères. Pour ces raisons, de nombreux chercheurs utilisent les embryons et larves de mouches pour répondre aux questions liées à divers domaines allant de la biologie comportementale à celle du développement. Les embryons et larves doivent cependant être prélevés avant expérimentation.

Cette vidéo va tout d’abord montrer comment les pondoirs sont utilisés pour la culture d’embryons de drosophile sur plaque de gélose. Le prélèvement et la déchorionation des embryons seront alors décrits. Cette vidéo dévoilera ensuite comment identifier et manipuler les drosophiles lors de l’un des trois stades larvaires qui suivent le stade embryonnaire. Cette vidéo se termine en donnant des exemples d’utilisation des embryons et larves de mouche pour la recherche biologique.

Procedure

Les embryons et les larves de Drosophila melanogaster sont faciles à manipuler et leur développement s’effectue selon des mécanismes existant dans d’autres organismes tels que les mammifères. L’apprentissage du prélèvement et de la préparation des embryons et larves est une étape préliminaire à beaucoup de processus expérimentaux allant de la biologie comportementale à celle du développement. Cette vidéo va porter sur les méthodes standards de culture et de prélèvement d’embryons et de larves de drosophiles, procédures essentielles à l’utilisation de cet organisme modèle polyvalent.

L’étude de l’embryon de la drosophile a fourni un excellent aperçu de la façon dont les gènes régulent le développement, que ce soit l’ARN messager exprimé comme un gradient dans l’ovocyte, ou les gènes qui génèrent le plan du corps segmenté suivant l’axe antéro-postérieur. Certains de ces gènes, tels que les gènes à boîte homéotique, sont hautement conservés entre cet insecte et les mammifères.

La nature robuste des embryons de drosophile leur permet de résister à des environnements hostiles et aux produits chimiques, ce qui les rend extrêmement pratiques à étudier.

Après fécondation, une mouche femelle peut pondre jusqu’à 100 embryons par jour, qui écloront en larves après 12 à 15 heures.

Pour manipuler les embryons de drosophile, ceux-ci doivent d’abord être cultivés.

Les embryons sont cultivés dans des chambres de ponte souvent appelées “pondoirs”.

Pour assembler le pondoir, faites premièrement des trous dans le récipient ou coupez-en une partie et couvrez le avec un matériau poreux pour permettre la ventilation. Prenez ensuite une plaque de gélose au jus de pomme ou de raisin, disposez-y la pâte de levure en stries et grattez les plaques en leur centre. La présence de pâte de levure entrainera la ponte.

Ajoutez rapidement les mouches au pondoir, retournez le pondoir afin d’avoir la plaque au fond de celui-ci et placez-le dans l’incubateur. Après écoulement du temps d’incubation souhaité, retournez le pondoir et tapez-le énergiquement sur la paillasse 2 ou 3 fois. Les mouches tombent au fond du pondoir et sont momentanément désorientées. Remplacez rapidement l’ancienne plaque de gélose avec une nouvelle plaque couverte de pâte de levure. Pour obtenir des embryons ayant un âge optimal, changez les plaques toutes les 1 à 3 heures.

Les plaques contiendront des centaines d’embryons, particulièrement près des stries et de la levure. 20 mouches de chaque sexe doivent produire 100 à 200 embryons par heure. Les embryons peuvent maintenant être prélevés.

Les outils nécessaires au prélèvement des embryons sont: une passoire ou un tamis, qui peut varier considérablement en taille et en complexité, un pinceau et de l’eau distillée.

Tout d’abord, détachez les embryons en immergeant les plaques dans de l’eau distillée tout en brossant gentiment la surface avec un pinceau. Eliminez ensuite le liquide par filtration en versant le mélange sur le tamis. Rincez les embryons à l’eau.

Le rinçage est souvent suivi par une étape de déchorionation, l’élimination de la membrane extérieure dure de l’embryon, ou chorion.

La déchorionation peut être effectuée manuellement par la dissection de l’embryon hors de l’enveloppe de chorion. Une autre option est de placer les embryons dans une solution d’eau de javel à 50%. Le chorion se dissout en 2 à 10 minutes, comme l’indique la disparition des appendices dorsaux. Rincez abondamment à l’eau distillée de façon à vous assurer que l’embryon nu n’est pas endommagé par l’eau de javel. La déchorionation est une étape pré-requise aux techniques telles que la micro-injection ou l’imagerie en temps réel.

Maintenant que vous avez un aperçu de l’embryologie, de la culture et du prélèvement des embryons, continuons avec la prochaine étape du cycle de vie de la drosophile : la larve.

Les larves de drosophiles ont trois stades larvaires ou mues. Le premier stade dure une journée, le deuxième encore une journée, et le troisième deux jours de plus. Les larves dans leur premier ou deuxième stade larvaire se trouvent dans la nourriture du flacon entre 1 et 3 jours après la mise en place d’un croisement. Au 4ème jour, les larves du 3ème stade larvaire migrent sur les parois du flacon où elles finiront par former des cocons appelés les pupes.

Les larves sont souvent utilisées expérimentalement en raison de leurs disques imaginaux. Les disques imaginaux sont des organes partiellement développés connus pour former des organes entiers chez la mouche adulte. Par exemple, un disque imaginal de l’œil deviendra l’œil adulte, des disques d’antennes deviendront les antennes et des disques imaginaux des ailes deviendront les ailes. L’étude des disques imaginaux a débouché à des découvertes majeures chez la drosophile, notamment le rôle des gènes homéotiques dans la formation des structures.

La culture de larves est plus simple que celle d’embryons car elle ne nécessite pas le transfert des mouches dans des chambres spéciales.

Les larves peuvent être retirées individuellement à l’aide de pinces ou de spatules. Pour la collecte de grandes quantités de larves au premier stade larvaire, vous pouvez utiliser une méthode alternative à base de solution de saccharose. Cette solution est plus dense que les larves et les fait flotter.

Ajoutez la solution de saccharose au flacon, ce qui fait remonter les larves à la surface. Séparez la nourriture en plaçant le flacon sous rotation. Enlevez alors les larves avec un pinceau ou une pipette, et récoltez-les pour les expériences.

Maintenant que nous avons décrit les techniques de culture et de prélèvement d’embryons et de larves, voyons quelles sont leurs applications expérimentales.

Les larves de drosophiles étant mobiles, elles peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.

Ici, vous voyez un “test rampant”, qui est utilisé pour évaluer le comportement locomoteur de la drosophile sous des conditions spécifiques. Le test rampant mesure la distance de déplacement des larves afin d’observer les effets d’un médicament sur la fonction motrice. Les larves prélevées sont immergées dans une solution de saccharose contenant un médicament connu pour compromettre la motilité.

La micro-injection est une procédure utilisée pour créer des mouches de fruit génétiquement modifiées, connues comme mutants transgéniques, par l’insertion d’un matériel génétique conçu sur mesure sous la forme d’un plasmide d’ADN circulaire.

Ces embryons sont déchorionés en les roulant physiquement sur du scotch double face afin d’éviter que les produits chimiques ne les détériorent. Les embryons peuvent alors être soumis à l’injection de plasmides qui codent des protéines, telles que la tubuline couplées avec des protéines rapporteuses de fluorescence telles que la GFP. Des expériences peuvent alors être effectuées pour visualiser les procédés cellulaires tels que la mitose dans des lignées de mouches transgéniques connues.

Les embryons peuvent être utilisés pour observer la présence de produits de transcription par hybridation fluorescente in situ.

Dans cette expérience, la présence d’un produit désiré issu de transcription d’ARNm est observée dans les embryons entiers par microscopie à fluorescence. Les embryons sont immobilisés par une solution bi-phasique qui les déchorione et par conséquent les prépare au marquage. Les embryons déchorionés sont localisés dans la couche inférieure. Après marquage par immunofluorescence, la présence de la protéine d’intérêt peut être observée par microscopie à fluorescence.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le prélèvement et la préparation d’embryons et de larves. Nous avons décrit la culture, le prélèvement et la préparation des embryons et des larves ainsi que certaines applications importantes liées aux organismes lors des premières étapes de développement. Merci de votre attention!

Transcript

Drosophila melanogaster embryos and larvae are easy to manipulate and their development is guided by mechanisms that exist in other organisms, including mammals. Learning to harvest and prepare embryos and larvae is a preliminary step in many experimental processes from behavioral to developmental biology. This video will cover the standard methods for collecting and harvesting Drosophila embryos and larvae, essential procedures in the use of this versatile model organism.

The study of the Drosophila embryo has provided great insight into the manner by which genes regulate development, from the mRNA that is expressed as a gradient in the oocyte, to the genes that form the anterior-to-posterior segmented body plan. Some of these genes, like the homeobox genes are highly conserved between this insect and mammals.

The hearty nature of Drosophila embryos allows them to withstand exposure to harsh environments and chemicals, which makes them extremely practical to study.

After fertilization one female fly can lay up to 100 embryos per day, which will hatch into larvae after 12-15 hours.

In order to manipulate Drosophila embryos, they must first be collected.

Embryos are collected in egg-laying chambers often referred to as “egg-laying cups”.

To assemble the laying cup, first poke holes or cut out part of a container and cover it with porous material to allow for ventilation. Then obtain an apple or grape juice agar plate, streak it with yeast paste, and scratch the plates in the center. The presence of yeast paste will induce egg laying.

Quickly add flies to the egg-laying chamber, invert the chamber so the plate is at the bottom, and allow it to incubate. After the desired incubation time invert the egg chamber and bang it on the bench top a few times. The flies fall to the bottom and are briefly disoriented. Quickly replace the old agar plate with the fresh plate layered with the yeast paste. To acquire the best-aged embryos change the plates every 1-3 hours.

Plates will have hundreds of embryos, especially near the scratches and yeast.

20 flies of each sex should produce 100-200 embryos per hour. Now the embryos can be harvested.

The tools needed for embryo harvesting are a strainer or sieve, which can vary greatly in size and complexity, a paintbrush, and distilled water.

First, loosen embryos by immersing the plate with distilled water, gently brushing the surface with a paintbrush. Next, filter out liquid by pouring the mixture into the sieve. Rinse the embryos with water.

Rinsing is often followed by dechorionation — the removal of the hard outer membrane of the embryo, or chorion.

Dechorionation can be done manually via a dissection of the embryo out of the chorionic sheath. Alternatively, embryos can be placed into 50% bleach. It takes 2-10 minutes for the chorion to dissolve, as noted by the disappearance of the dorsal appendages. Rinse thoroughly with distilled water to make sure the naked embryo is undamaged by bleach. Dechorionation is a prerequisite to techniques like microinjection and live cell imaging.

Now that you have gotten a sense of embryo biology, collection, and harvesting, let’s move on to the next stage in the Drosophila life cycle: larvae.

Drosophila larvae have three “instar,” or molting, stages. The first instar lasts one day, the second another day, and the third two more days. First and second instar larvae are found in the food of the vial 1-3 days after setting up a cross. On the 4th day, third instar larvae migrate up, or “wander” up the sides of the container, where they will ultimately form cocoons called pupae.

Larvae are often used for experimentation because of their imaginal discs. Imaginal discs are partially developed organs that are known to become whole parts of the adult fly. For example, an imaginal eye disc will become an adult eye, antennal discs will become antennae, and imaginal wing discs will become wings. The study of imaginal discs has led to important discoveries in Drosophila, such as the role of homeobox genes in pattern formation.

Larvae collection is simpler than embryo collection, because it does not require the transfer of flies into special housing.

Individual larva can be removed with tweezers or a spatula. When collecting a large number of early stage larvae you can employ an alternative collection method using a sucrose solution, which is more dense than the larvae and causes them to float.

Add sucrose solution to the vial, which buoys larvae to the top. Dislodge the food by placing the vial on a rotator. Then remove larvae with a brush or pipette and harvest for experiments.

Now that we’ve covered collection and harvesting techniques for embryos and larvae, now let’s see how to apply them to experimentation.

Since they are mobile, Drosophila larvae can be used for behavioral experiments.

Here you see a “crawling assay”, which is used to evaluate Drosophila locomotor behavior under specific conditions. The crawling assay measures the distance the larva travels, in order to observe the effects of a drug on motor function. Collected larvae are immersed in a drugged sucrose solution that is predicted to interfere with motility.

Microinjection is a procedure for creating genetically modified fruit flies, known as transgenic mutants, by inserting customized genetic material in the form of a circular DNA plasmid.

These embryos are dechorionated by physically rolling them on double-sided tape so chemicals won’t damage them. Embryos can then be injected with plasmids that encode proteins, like tubulin, fused with fluorescent reporter proteins, like GFP. Experiments can then be performed to visualize cellular processes like mitosis from established transgenic fly lines.

Embryos can be used to visualize the presence of transcripts through fluorescent in situ hybridization.

In this experiment, whole embryos are observed for the presence of a desired mRNA transcript via fluorescence microscopy. The embryos are fixed using a biphasic solution that dechorionates, and therefore prepares the embryo for staining. The naked embryos are on the bottom layer. After immunofluorescent staining, the presence of the desired protein can be seen using fluorescence microscopy.

You’ve just watched JoVE’s embryo and larva harvesting and preparation video. We reviewed the collection, harvesting, and preparation of embryos and larvae and some important applications applied to the early stage organisms. Thanks for watching!