Les embryons et les larves de Drosophila melanogaster sont faciles à manipuler et leur développement s'effectue selon des mécanismes existant dans d’autres organismes tels que les mammifères. L’apprentissage du prélèvement et de la préparation des embryons et larves est une étape préliminaire à beaucoup de processus expérimentaux allant de la biologie comportementale à celle du développement. Cette vidéo va porter sur les méthodes standards de culture et de prélèvement d’embryons et de larves de drosophiles, procédures essentielles à l’utilisation de cet organisme modèle polyvalent.
L’étude de l’embryon de la drosophile a fourni un excellent aperçu de la façon dont les gènes régulent le développement, que ce soit l’ARN messager exprimé comme un gradient dans l’ovocyte, ou les gènes qui génèrent le plan du corps segmenté suivant l’axe antéro-postérieur. Certains de ces gènes, tels que les gènes à boîte homéotique, sont hautement conservés entre cet insecte et les mammifères.
La nature robuste des embryons de drosophile leur permet de résister à des environnements hostiles et aux produits chimiques, ce qui les rend extrêmement pratiques à étudier.
Après fécondation, une mouche femelle peut pondre jusqu’à 100 embryons par jour, qui écloront en larves après 12 à 15 heures.
Pour manipuler les embryons de drosophile, ceux-ci doivent d’abord être cultivés.
Les embryons sont cultivés dans des chambres de ponte souvent appelées "pondoirs".
Pour assembler le pondoir, faites premièrement des trous dans le récipient ou coupez-en une partie et couvrez le avec un matériau poreux pour permettre la ventilation. Prenez ensuite une plaque de gélose au jus de pomme ou de raisin, disposez-y la pâte de levure en stries et grattez les plaques en leur centre. La présence de pâte de levure entrainera la ponte.
Ajoutez rapidement les mouches au pondoir, retournez le pondoir afin d’avoir la plaque au fond de celui-ci et placez-le dans l’incubateur. Après écoulement du temps d’incubation souhaité, retournez le pondoir et tapez-le énergiquement sur la paillasse 2 ou 3 fois. Les mouches tombent au fond du pondoir et sont momentanément désorientées. Remplacez rapidement l’ancienne plaque de gélose avec une nouvelle plaque couverte de pâte de levure. Pour obtenir des embryons ayant un âge optimal, changez les plaques toutes les 1 à 3 heures.
Les plaques contiendront des centaines d’embryons, particulièrement près des stries et de la levure. 20 mouches de chaque sexe doivent produire 100 à 200 embryons par heure. Les embryons peuvent maintenant être prélevés.
Les outils nécessaires au prélèvement des embryons sont: une passoire ou un tamis, qui peut varier considérablement en taille et en complexité, un pinceau et de l’eau distillée.
Tout d'abord, détachez les embryons en immergeant les plaques dans de l’eau distillée tout en brossant gentiment la surface avec un pinceau. Eliminez ensuite le liquide par filtration en versant le mélange sur le tamis. Rincez les embryons à l’eau.
Le rinçage est souvent suivi par une étape de déchorionation, l’élimination de la membrane extérieure dure de l’embryon, ou chorion.
La déchorionation peut être effectuée manuellement par la dissection de l’embryon hors de l'enveloppe de chorion. Une autre option est de placer les embryons dans une solution d’eau de javel à 50%. Le chorion se dissout en 2 à 10 minutes, comme l'indique la disparition des appendices dorsaux. Rincez abondamment à l’eau distillée de façon à vous assurer que l’embryon nu n’est pas endommagé par l’eau de javel. La déchorionation est une étape pré-requise aux techniques telles que la micro-injection ou l’imagerie en temps réel.
Maintenant que vous avez un aperçu de l’embryologie, de la culture et du prélèvement des embryons, continuons avec la prochaine étape du cycle de vie de la drosophile : la larve.
Les larves de drosophiles ont trois stades larvaires ou mues. Le premier stade dure une journée, le deuxième encore une journée, et le troisième deux jours de plus. Les larves dans leur premier ou deuxième stade larvaire se trouvent dans la nourriture du flacon entre 1 et 3 jours après la mise en place d’un croisement. Au 4ème jour, les larves du 3ème stade larvaire migrent sur les parois du flacon où elles finiront par former des cocons appelés les pupes.
Les larves sont souvent utilisées expérimentalement en raison de leurs disques imaginaux. Les disques imaginaux sont des organes partiellement développés connus pour former des organes entiers chez la mouche adulte. Par exemple, un disque imaginal de l’œil deviendra l’œil adulte, des disques d’antennes deviendront les antennes et des disques imaginaux des ailes deviendront les ailes. L’étude des disques imaginaux a débouché à des découvertes majeures chez la drosophile, notamment le rôle des gènes homéotiques dans la formation des structures.
La culture de larves est plus simple que celle d'embryons car elle ne nécessite pas le transfert des mouches dans des chambres spéciales.
Les larves peuvent être retirées individuellement à l’aide de pinces ou de spatules. Pour la collecte de grandes quantités de larves au premier stade larvaire, vous pouvez utiliser une méthode alternative à base de solution de saccharose. Cette solution est plus dense que les larves et les fait flotter.
Ajoutez la solution de saccharose au flacon, ce qui fait remonter les larves à la surface. Séparez la nourriture en plaçant le flacon sous rotation. Enlevez alors les larves avec un pinceau ou une pipette, et récoltez-les pour les expériences.
Maintenant que nous avons décrit les techniques de culture et de prélèvement d'embryons et de larves, voyons quelles sont leurs applications expérimentales.
Les larves de drosophiles étant mobiles, elles peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.
Ici, vous voyez un "test rampant", qui est utilisé pour évaluer le comportement locomoteur de la drosophile sous des conditions spécifiques. Le test rampant mesure la distance de déplacement des larves afin d’observer les effets d’un médicament sur la fonction motrice. Les larves prélevées sont immergées dans une solution de saccharose contenant un médicament connu pour compromettre la motilité.
La micro-injection est une procédure utilisée pour créer des mouches de fruit génétiquement modifiées, connues comme mutants transgéniques, par l’insertion d’un matériel génétique conçu sur mesure sous la forme d’un plasmide d’ADN circulaire.
Ces embryons sont déchorionés en les roulant physiquement sur du scotch double face afin d’éviter que les produits chimiques ne les détériorent. Les embryons peuvent alors être soumis à l'injection de plasmides qui codent des protéines, telles que la tubuline couplées avec des protéines rapporteuses de fluorescence telles que la GFP. Des expériences peuvent alors être effectuées pour visualiser les procédés cellulaires tels que la mitose dans des lignées de mouches transgéniques connues.
Les embryons peuvent être utilisés pour observer la présence de produits de transcription par hybridation fluorescente in situ.
Dans cette expérience, la présence d’un produit désiré issu de transcription d'ARNm est observée dans les embryons entiers par microscopie à fluorescence. Les embryons sont immobilisés par une solution bi-phasique qui les déchorione et par conséquent les prépare au marquage. Les embryons déchorionés sont localisés dans la couche inférieure. Après marquage par immunofluorescence, la présence de la protéine d'intérêt peut être observée par microscopie à fluorescence.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le prélèvement et la préparation d’embryons et de larves. Nous avons décrit la culture, le prélèvement et la préparation des embryons et des larves ainsi que certaines applications importantes liées aux organismes lors des premières étapes de développement. Merci de votre attention!
Les embryons et larves de Drosophila melanogaster sont facilement manipulables et se développent rapidement via des mécanismes analogues à ceux d’autr…
Les embryons et les larves de Drosophila melanogaster sont faciles à manipuler et leur développement s'effectue selon des mécanismes existant dans d’autres organismes tels que les mammifères. L’apprentissage du prélèvement et de la préparation des embryons et larves est une étape préliminaire à beaucoup de processus expérimentaux allant de la biologie comportementale à celle du développement. Cette vidéo va porter sur les méthodes standards de culture et de prélèvement d’embryons et de larves de drosophiles, procédures essentielles à l’utilisation de cet organisme modèle polyvalent.
L’étude de l’embryon de la drosophile a fourni un excellent aperçu de la façon dont les gènes régulent le développement, que ce soit l’ARN messager exprimé comme un gradient dans l’ovocyte, ou les gènes qui génèrent le plan du corps segmenté suivant l’axe antéro-postérieur. Certains de ces gènes, tels que les gènes à boîte homéotique, sont hautement conservés entre cet insecte et les mammifères.
La nature robuste des embryons de drosophile leur permet de résister à des environnements hostiles et aux produits chimiques, ce qui les rend extrêmement pratiques à étudier.
Après fécondation, une mouche femelle peut pondre jusqu’à 100 embryons par jour, qui écloront en larves après 12 à 15 heures.
Pour manipuler les embryons de drosophile, ceux-ci doivent d’abord être cultivés.
Les embryons sont cultivés dans des chambres de ponte souvent appelées "pondoirs".
Pour assembler le pondoir, faites premièrement des trous dans le récipient ou coupez-en une partie et couvrez le avec un matériau poreux pour permettre la ventilation. Prenez ensuite une plaque de gélose au jus de pomme ou de raisin, disposez-y la pâte de levure en stries et grattez les plaques en leur centre. La présence de pâte de levure entrainera la ponte.
Ajoutez rapidement les mouches au pondoir, retournez le pondoir afin d’avoir la plaque au fond de celui-ci et placez-le dans l’incubateur. Après écoulement du temps d’incubation souhaité, retournez le pondoir et tapez-le énergiquement sur la paillasse 2 ou 3 fois. Les mouches tombent au fond du pondoir et sont momentanément désorientées. Remplacez rapidement l’ancienne plaque de gélose avec une nouvelle plaque couverte de pâte de levure. Pour obtenir des embryons ayant un âge optimal, changez les plaques toutes les 1 à 3 heures.
Les plaques contiendront des centaines d’embryons, particulièrement près des stries et de la levure. 20 mouches de chaque sexe doivent produire 100 à 200 embryons par heure. Les embryons peuvent maintenant être prélevés.
Les outils nécessaires au prélèvement des embryons sont: une passoire ou un tamis, qui peut varier considérablement en taille et en complexité, un pinceau et de l’eau distillée.
Tout d'abord, détachez les embryons en immergeant les plaques dans de l’eau distillée tout en brossant gentiment la surface avec un pinceau. Eliminez ensuite le liquide par filtration en versant le mélange sur le tamis. Rincez les embryons à l’eau.
Le rinçage est souvent suivi par une étape de déchorionation, l’élimination de la membrane extérieure dure de l’embryon, ou chorion.
La déchorionation peut être effectuée manuellement par la dissection de l’embryon hors de l'enveloppe de chorion. Une autre option est de placer les embryons dans une solution d’eau de javel à 50%. Le chorion se dissout en 2 à 10 minutes, comme l'indique la disparition des appendices dorsaux. Rincez abondamment à l’eau distillée de façon à vous assurer que l’embryon nu n’est pas endommagé par l’eau de javel. La déchorionation est une étape pré-requise aux techniques telles que la micro-injection ou l’imagerie en temps réel.
Maintenant que vous avez un aperçu de l’embryologie, de la culture et du prélèvement des embryons, continuons avec la prochaine étape du cycle de vie de la drosophile : la larve.
Les larves de drosophiles ont trois stades larvaires ou mues. Le premier stade dure une journée, le deuxième encore une journée, et le troisième deux jours de plus. Les larves dans leur premier ou deuxième stade larvaire se trouvent dans la nourriture du flacon entre 1 et 3 jours après la mise en place d’un croisement. Au 4ème jour, les larves du 3ème stade larvaire migrent sur les parois du flacon où elles finiront par former des cocons appelés les pupes.
Les larves sont souvent utilisées expérimentalement en raison de leurs disques imaginaux. Les disques imaginaux sont des organes partiellement développés connus pour former des organes entiers chez la mouche adulte. Par exemple, un disque imaginal de l’œil deviendra l’œil adulte, des disques d’antennes deviendront les antennes et des disques imaginaux des ailes deviendront les ailes. L’étude des disques imaginaux a débouché à des découvertes majeures chez la drosophile, notamment le rôle des gènes homéotiques dans la formation des structures.
La culture de larves est plus simple que celle d'embryons car elle ne nécessite pas le transfert des mouches dans des chambres spéciales.
Les larves peuvent être retirées individuellement à l’aide de pinces ou de spatules. Pour la collecte de grandes quantités de larves au premier stade larvaire, vous pouvez utiliser une méthode alternative à base de solution de saccharose. Cette solution est plus dense que les larves et les fait flotter.
Ajoutez la solution de saccharose au flacon, ce qui fait remonter les larves à la surface. Séparez la nourriture en plaçant le flacon sous rotation. Enlevez alors les larves avec un pinceau ou une pipette, et récoltez-les pour les expériences.
Maintenant que nous avons décrit les techniques de culture et de prélèvement d'embryons et de larves, voyons quelles sont leurs applications expérimentales.
Les larves de drosophiles étant mobiles, elles peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.
Ici, vous voyez un "test rampant", qui est utilisé pour évaluer le comportement locomoteur de la drosophile sous des conditions spécifiques. Le test rampant mesure la distance de déplacement des larves afin d’observer les effets d’un médicament sur la fonction motrice. Les larves prélevées sont immergées dans une solution de saccharose contenant un médicament connu pour compromettre la motilité.
La micro-injection est une procédure utilisée pour créer des mouches de fruit génétiquement modifiées, connues comme mutants transgéniques, par l’insertion d’un matériel génétique conçu sur mesure sous la forme d’un plasmide d’ADN circulaire.
Ces embryons sont déchorionés en les roulant physiquement sur du scotch double face afin d’éviter que les produits chimiques ne les détériorent. Les embryons peuvent alors être soumis à l'injection de plasmides qui codent des protéines, telles que la tubuline couplées avec des protéines rapporteuses de fluorescence telles que la GFP. Des expériences peuvent alors être effectuées pour visualiser les procédés cellulaires tels que la mitose dans des lignées de mouches transgéniques connues.
Les embryons peuvent être utilisés pour observer la présence de produits de transcription par hybridation fluorescente in situ.
Dans cette expérience, la présence d’un produit désiré issu de transcription d'ARNm est observée dans les embryons entiers par microscopie à fluorescence. Les embryons sont immobilisés par une solution bi-phasique qui les déchorione et par conséquent les prépare au marquage. Les embryons déchorionés sont localisés dans la couche inférieure. Après marquage par immunofluorescence, la présence de la protéine d'intérêt peut être observée par microscopie à fluorescence.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le prélèvement et la préparation d’embryons et de larves. Nous avons décrit la culture, le prélèvement et la préparation des embryons et des larves ainsi que certaines applications importantes liées aux organismes lors des premières étapes de développement. Merci de votre attention!
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Les embryons et les larves de Drosophila melanogaster sont faciles à manipuler et leur développement s'effectue selon des mécanismes existant dans d’autres organismes tels que les mammifères. L’apprentissage du prélèvement et de la préparation des embryons et larves est une étape préliminaire à beaucoup de processus expérimentaux allant de la biologie comportementale à celle du développement. Cette vidéo va porter sur les méthodes standards de culture et de prélèvement d’embryons et de larves de drosophiles, procédures essentielles à l’utilisation de cet organisme modèle polyvalent.
L’étude de l’embryon de la drosophile a fourni un excellent aperçu de la façon dont les gènes régulent le développement, que ce soit l’ARN messager exprimé comme un gradient dans l’ovocyte, ou les gènes qui génèrent le plan du corps segmenté suivant l’axe antéro-postérieur. Certains de ces gènes, tels que les gènes à boîte homéotique, sont hautement conservés entre cet insecte et les mammifères.
La nature robuste des embryons de drosophile leur permet de résister à des environnements hostiles et aux produits chimiques, ce qui les rend extrêmement pratiques à étudier.
Après fécondation, une mouche femelle peut pondre jusqu’à 100 embryons par jour, qui écloront en larves après 12 à 15 heures.
Pour manipuler les embryons de drosophile, ceux-ci doivent d’abord être cultivés.
Les embryons sont cultivés dans des chambres de ponte souvent appelées "pondoirs".
Pour assembler le pondoir, faites premièrement des trous dans le récipient ou coupez-en une partie et couvrez le avec un matériau poreux pour permettre la ventilation. Prenez ensuite une plaque de gélose au jus de pomme ou de raisin, disposez-y la pâte de levure en stries et grattez les plaques en leur centre. La présence de pâte de levure entrainera la ponte.
Ajoutez rapidement les mouches au pondoir, retournez le pondoir afin d’avoir la plaque au fond de celui-ci et placez-le dans l’incubateur. Après écoulement du temps d’incubation souhaité, retournez le pondoir et tapez-le énergiquement sur la paillasse 2 ou 3 fois. Les mouches tombent au fond du pondoir et sont momentanément désorientées. Remplacez rapidement l’ancienne plaque de gélose avec une nouvelle plaque couverte de pâte de levure. Pour obtenir des embryons ayant un âge optimal, changez les plaques toutes les 1 à 3 heures.
Les plaques contiendront des centaines d’embryons, particulièrement près des stries et de la levure. 20 mouches de chaque sexe doivent produire 100 à 200 embryons par heure. Les embryons peuvent maintenant être prélevés.
Les outils nécessaires au prélèvement des embryons sont: une passoire ou un tamis, qui peut varier considérablement en taille et en complexité, un pinceau et de l’eau distillée.
Tout d'abord, détachez les embryons en immergeant les plaques dans de l’eau distillée tout en brossant gentiment la surface avec un pinceau. Eliminez ensuite le liquide par filtration en versant le mélange sur le tamis. Rincez les embryons à l’eau.
Le rinçage est souvent suivi par une étape de déchorionation, l’élimination de la membrane extérieure dure de l’embryon, ou chorion.
La déchorionation peut être effectuée manuellement par la dissection de l’embryon hors de l'enveloppe de chorion. Une autre option est de placer les embryons dans une solution d’eau de javel à 50%. Le chorion se dissout en 2 à 10 minutes, comme l'indique la disparition des appendices dorsaux. Rincez abondamment à l’eau distillée de façon à vous assurer que l’embryon nu n’est pas endommagé par l’eau de javel. La déchorionation est une étape pré-requise aux techniques telles que la micro-injection ou l’imagerie en temps réel.
Maintenant que vous avez un aperçu de l’embryologie, de la culture et du prélèvement des embryons, continuons avec la prochaine étape du cycle de vie de la drosophile : la larve.
Les larves de drosophiles ont trois stades larvaires ou mues. Le premier stade dure une journée, le deuxième encore une journée, et le troisième deux jours de plus. Les larves dans leur premier ou deuxième stade larvaire se trouvent dans la nourriture du flacon entre 1 et 3 jours après la mise en place d’un croisement. Au 4ème jour, les larves du 3ème stade larvaire migrent sur les parois du flacon où elles finiront par former des cocons appelés les pupes.
Les larves sont souvent utilisées expérimentalement en raison de leurs disques imaginaux. Les disques imaginaux sont des organes partiellement développés connus pour former des organes entiers chez la mouche adulte. Par exemple, un disque imaginal de l’œil deviendra l’œil adulte, des disques d’antennes deviendront les antennes et des disques imaginaux des ailes deviendront les ailes. L’étude des disques imaginaux a débouché à des découvertes majeures chez la drosophile, notamment le rôle des gènes homéotiques dans la formation des structures.
La culture de larves est plus simple que celle d'embryons car elle ne nécessite pas le transfert des mouches dans des chambres spéciales.
Les larves peuvent être retirées individuellement à l’aide de pinces ou de spatules. Pour la collecte de grandes quantités de larves au premier stade larvaire, vous pouvez utiliser une méthode alternative à base de solution de saccharose. Cette solution est plus dense que les larves et les fait flotter.
Ajoutez la solution de saccharose au flacon, ce qui fait remonter les larves à la surface. Séparez la nourriture en plaçant le flacon sous rotation. Enlevez alors les larves avec un pinceau ou une pipette, et récoltez-les pour les expériences.
Maintenant que nous avons décrit les techniques de culture et de prélèvement d'embryons et de larves, voyons quelles sont leurs applications expérimentales.
Les larves de drosophiles étant mobiles, elles peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.
Ici, vous voyez un "test rampant", qui est utilisé pour évaluer le comportement locomoteur de la drosophile sous des conditions spécifiques. Le test rampant mesure la distance de déplacement des larves afin d’observer les effets d’un médicament sur la fonction motrice. Les larves prélevées sont immergées dans une solution de saccharose contenant un médicament connu pour compromettre la motilité.
La micro-injection est une procédure utilisée pour créer des mouches de fruit génétiquement modifiées, connues comme mutants transgéniques, par l’insertion d’un matériel génétique conçu sur mesure sous la forme d’un plasmide d’ADN circulaire.
Ces embryons sont déchorionés en les roulant physiquement sur du scotch double face afin d’éviter que les produits chimiques ne les détériorent. Les embryons peuvent alors être soumis à l'injection de plasmides qui codent des protéines, telles que la tubuline couplées avec des protéines rapporteuses de fluorescence telles que la GFP. Des expériences peuvent alors être effectuées pour visualiser les procédés cellulaires tels que la mitose dans des lignées de mouches transgéniques connues.
Les embryons peuvent être utilisés pour observer la présence de produits de transcription par hybridation fluorescente in situ.
Dans cette expérience, la présence d’un produit désiré issu de transcription d'ARNm est observée dans les embryons entiers par microscopie à fluorescence. Les embryons sont immobilisés par une solution bi-phasique qui les déchorione et par conséquent les prépare au marquage. Les embryons déchorionés sont localisés dans la couche inférieure. Après marquage par immunofluorescence, la présence de la protéine d'intérêt peut être observée par microscopie à fluorescence.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le prélèvement et la préparation d’embryons et de larves. Nous avons décrit la culture, le prélèvement et la préparation des embryons et des larves ainsi que certaines applications importantes liées aux organismes lors des premières étapes de développement. Merci de votre attention!
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Q1: How do you set up an egg-laying chamber to collect Drosophila embryos?
Create an egg-laying cup by poking holes in a container and covering it with porous material for ventilation. Prepare an apple or grape juice agar plate, streak it with yeast paste, and scratch the center. Add flies to the chamber, invert it so the plate is at the bottom, and incubate. Replace the plate every 1-3 hours to obtain best-aged embryos. Twenty flies of each sex produce 100-200 embryos per hour.
Q2: What is the purpose of dechorionation in Drosophila embryo preparation?
Dechorionation removes the hard outer membrane, or chorion, from embryos, which is essential for techniques like microinjection and live cell imaging. This can be done manually by dissecting the embryo from its chorionic sheath or chemically using 50% bleach for 2-10 minutes. Thorough rinsing with distilled water ensures the naked embryo remains undamaged.
Q3: How are Drosophila larvae collected using a sucrose solution?
Add sucrose solution to the vial containing larvae; since it is denser than larvae, they float to the top. Place the vial on a rotator to dislodge food from the medium. Remove larvae with a brush or pipette for harvesting and experimentation. This method is more efficient than manual collection when gathering large numbers of early-stage larvae.
Q4: What are imaginal discs and why are they important in Drosophila research?
Imaginal discs are partially developed organs in larvae that become whole adult structures. An imaginal eye disc becomes an adult eye, antennal discs become antennae, and wing discs become wings. Study of imaginal discs has revealed important discoveries about development and reproduction drosophila melanogaster, including the role of homeobox genes in pattern formation.
Q5: What are the three larval instar stages in Drosophila development?
Drosophila larvae progress through three instar, or molting, stages. The first instar lasts one day, the second instar lasts one day, and the third instar lasts two days. First and second instar larvae are found in food 1-3 days after setting up a cross. On day four, third instar larvae migrate up the container sides to form pupae.
Q6: How is microinjection used to create transgenic Drosophila mutants?
Microinjection inserts customized genetic material in the form of circular DNA plasmids into dechorionated embryos. Embryos are dechorionated by physically rolling them on double-sided tape to avoid chemical damage. Plasmids encoding proteins like tubulin fused with fluorescent reporter proteins such as GFP can be injected to create transgenic fly lines for visualizing cellular processes.
Q7: What does a crawling assay measure in Drosophila larvae?
A crawling assay evaluates Drosophila locomotor behavior by measuring the distance a larva travels under specific conditions. Collected larvae are immersed in a drugged sucrose solution predicted to interfere with motility, allowing researchers to observe the effects of drugs on motor function and behavioral responses.
Chapitres dans cette vidéo
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Overview
0:40
The Drosophila Embryo
1:25
Drosophila Embryo Collection
2:49
Drosophila Embryo Harvesting
4:00
Drosophila Larvae Overview
5:15
Drosophila Larvae Collection and Harvesting
5:58
Applications
7:49
Summary