3.4: Entretien des levures

Les découvertes importantes de la régulation du cycle cellulaire, de l’activité de la télomérase et de l’autophagie chez Saccharomyces cerevisiae ont prouvé que cette espèce de levure est un organisme modèle précieux pour la recherche. Les levures sont faciles à cultiver et les plasmides et souches de levure sont disponibles dans le commerce. Malgré les exigences relativement peu coûteuses pour la culture de la levure, le maintien de cet organisme est essentiel pour la réussite des expériences. Cette vidéo vous donnera un aperçu de la façon de cultiver des cultures de cellules de levure et de maintenir les souches de S. cerevisiae en laboratoire.

En biologie, les courbes de croissance représentent l’évolution de la population cellulaire sur une période de temps. Chez la levure, la courbe de croissance est générée en traçant la densité optique, ou « OD », de la culture cellulaire à 600 nm dans l’axe des y et dans le temps sur l’axe des x. La densité optique ou « absorbance » est le rapport logarithmique entre l’intensité de la lumière entrant dans la suspension de la cellule de levure et l’intensité qui la traverse. Le DO à une longueur d’onde spécifique de la lumière est mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre.

Lorsque l’on travaille avec des levures, la courbe de croissance de la souche de levure doit être générée en prenant des mesures de DO à différents intervalles de temps. La courbe de croissance de la levure est divisée en trois phases principales : lag, logarithmique et stationnaire. Pendant la phase de latence, les cellules s’acclimatent à l’environnement et grossissent mais ne se divisent pas. En phase logarithmique, les cellules se divisent activement, ce qui entraîne un doublement des cellules. Une fois que les nutriments disponibles sont épuisés, les cellules de levure entrent en phase stationnaire, où la division cellulaire ralentit et la population cellulaire reste constante.

À l’aide de la courbe de croissance, le temps de doublement de la déformation peut être calculé à l’aide de l’équation suivante : OD1 et OD2 représentent les mesures de densité optique, et T1 et T2 sont le temps entre les mesures. Le temps de doublement est défini comme le temps nécessaire pour qu’une population de cellules double en nombre de cellules. Calculez entre deux valeurs de DO en phase logarithmique, par exemple, entre les valeurs 0,2 et 0,5, comme indiqué ici. Les levures de type sauvage doivent donner une valeur de temps de doublage d’environ 90 minutes.

Connaître le temps de doublage est bénéfique car cela vous permettra de planifier vos expériences en conséquence tout au long de la journée.

Maintenant que nous avons couvert les rouages de la courbe de croissance de la levure, passons au laboratoire et faisons un peu de préparation pratique pour cultiver des cellules de levure. Les composantes majeures des médias de croissance riche ? AKA Nourriture à base de levure - sont : extrait de levure, peptone et une source de sucre. L’extrait de levure contient le contenu des cellules de levure, à l’exclusion de la paroi cellulaire, et fournit des acides aminés, des vitamines, des glucides et d’autres nutriments nécessaires à la croissance. La peptone est dérivée de la viande animale ou du lait et constitue la principale source d’acides aminés dans les milieux de levure. Une source de sucre, généralement du glucose, est ajoutée car elle fournit de l’énergie aux cellules en croissance.

Après avoir dissous l’extrait de levure et la peptonne dans l’eau, stérilisez le mélange à l’aide d’un autoclave. Pour faire des plaques de levure, ajoutez de la gélose au milieu liquide et versez le mélange dans des plaques, en lui permettant de se solidifier à température ambiante. Ces plaques peuvent être utilisées lors du striage de souches pour faire pousser des colonies de levures.

Maintenant que tous nos médias sont prêts, comment pouvons-nous cultiver ces bestioles à partir de rien ? Tout d’abord, assurez-vous que tous les instruments, solutions et milieux sont stériles.

Ensuite, procurez-vous une plaque pour strier les cellules de levure. Non, pas ce genre de streaking ! Le strieking est le processus d’étalement de cultures de levure liquide sur une plaque de gélose à l’aide d’un instrument stérile, comme vous le voyez ici. Autour des « stries », des colonies individuelles se formeront, qui sont dérivées d’une seule cellule de levure, qui peut être cueillie, afin d’obtenir une population génétique pure de cellules de levure. Une fois les plaques striées, retournez la plaque et placez-la dans un 30 ? C incubateur pendant 2 à 3 jours. C’est la température optimale pour la croissance des levures.

Une fois que les colonies se sont formées, inoculez les cellules de levure dans un petit volume de milieu de croissance. Inoculer ici signifie choisir une seule colonie et la présenter aux milieux en la mélangeant brièvement. Incuber la culture en 30 ? C agitateur ou rotateur pendant 48 heures.

Pour cultiver de plus grandes cultures de cellules, vérifiez d’abord l’OD600 de la culture de levure de 2 jours à l’aide d’un spectrophotomètre. Faites les dilutions appropriées de sorte que la DO de départ soit d’environ 0,1-0,2. Après avoir dilué les cellules, placez le ballon dans un flacon de 30 ? C et faites croître les cellules jusqu’à la DO souhaitée.

La prochaine leçon importante après avoir appris à cultiver S. cerevisiae est de savoir comment les stocker pour une utilisation future. Les levures cultivées sur plaques peuvent être conservées à 4 ? C jusqu’à 3 mois. Cependant, si vous souhaitez cultiver une culture fraîche, assurez-vous de réétaler les cellules sur une plaque fraîche avant d’inoculer.

Pour stocker des stocks de souches de levure pendant de longues périodes, aliquote les cellules dans des cryoflacons contenant du glycérol. Les cellules peuvent alors être stockées à -80 ? C, où ils peuvent rester jusqu’à plusieurs années.

Maintenant que vous êtes un pro de la culture de cellules de levure, voyons comment nous pouvons appliquer ces techniques essentielles dans la recherche scientifique. Les cellules en phase stationnaire peuvent être utilisées pour étudier les gènes qui régulent l’instabilité de l’ADN du génome au cours du vieillissement. Cette capsule vidéo montre la collection de cellules d’une culture vieille de trois jours. Ils sont plaqués sur un milieu sélectif qui empêche les cellules de levure normales de se développer. Seules les cellules qui ont acquis une mutation peuvent former des colonies sur ces plaques. Le nombre de colonies sur les plaques est proportionnel au niveau d’instabilité génomique dans la culture.

Un autre exemple d’étude du vieillissement est l’analyse de la durée de vie chronologique des cellules de levure. Le vieillissement chronologique dénote une perte de viabilité cellulaire sur une période de temps et peut être étudié par des cultures liquides en croissance, comme illustré ici. Dans cette vidéo, le scientifique charge diverses cultures sur la spécification afin de générer des courbes de croissance, ce qui aidera à déterminer la viabilité cellulaire.

Les cellules de levure de type sauvage en phase logarithmique représentent des cellules saines et normales et peuvent être utilisées pour étudier les organites eucaryotes, tels que le ribosome. Dans cette vidéo, vous pouvez voir la charge du lysat cellulaire à partir des cellules collectées en phase logarithmique vers un gradient de saccharose. Ensuite, les cellules sont filées pour sédimenter les ribosomes et un moniteur d’absorbance est utilisé pour générer le profil des ribosomes.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’élevage et à l’entretien de Saccharomyces cerevisiae. Dans cette vidéo, nous avons examiné la courbe de croissance de la levure, montré comment cultiver des cultures cellulaires et vous avons montré comment maintenir les souches de levure. Merci d’avoir regardé, et n’oubliez pas de recommander cette vidéo à un bourgeon.