La recherche effectuée sur la levure de Saccharomyces cerevisiae a grandement amélioré notre compréhension des phénomènes cellulaires tels que la régulation du cycle cellulaire, le vieillissement et la mort cellulaire. Les nombreux avantages du travail sur la S. cerevisiae incluent le faible coût de leur culture en laboratoire et la disponibilité dans le commerce de cellules souches prêtes à l’emploi. Un entretien approprié de cet organisme est cependant essentiel à la réussite des expériences. Cette vidéo vous donnera un aperçu des conditions de culture et d’entretien de la S. cerevisiae en laboratoire. Les concepts de base nécessaires au contrôle de la multiplication d’une population de levures tels que la façon d’obtenir une courbe de croissance à l’aide d’un spectrophotomètre sont présentés. Cette vidéo décrit également les techniques nécessaires à l’entretien de la S. cerevisiae en laboratoire, notamment la préparation des milieux de culture, le démarrage d’une nouvelle culture de cellules de levure et le stockage de ces cultures. Cette vidéo se termine en montrant comment certaines techniques de manipulation et d’entretien sont utilisées en recherche scientifique.
Les découvertes importantes sur la régulation du cycle cellulaire, sur l’activité de la télomèrase et sur l’autophagie dans la Saccharomyces cerevisiae, ont démontré l’utilité de cette espèce de levure comme organisme modèle pour la recherche. Les levures sont faciles à cultiver et les plasmides et souches de levures sont disponibles dans le commerce. Malgré les besoins relativement peu coûteux de la culture des levures, l’entretien de cet organisme est essentiel à la réussite des expériences. Cette vidéo vous apportera un regard interne sur la façon de cultiver et d’entretenir des souches de S. cerevisiae en laboratoire.
En biologie, les courbes de croissance représentent le changement de population des cellules sur une période de temps. Pour la levure, la courbe de croissance est obtenue en représentant la densité optique (ou “DO”) à 600 nm en ordonnée, et le temps en abscisse. La densité optique ou “absorbance” est le logarithme du rapport de l’intensité de la lumière traversant sur l’intensité de lumière transmise d’une suspension de cellules de levure. La DO à une longueur d’onde donnée est mesurée grâce à un spectrophotomètre.
Lorsque l’on travaille avec des levures, la courbe de croissance de la souche de levure doit être obtenue par la mesure de DO à différents intervalles de temps. La courbe de croissance est séparée en 3 phases principales: la phase de latence, la phase exponentielle et la phase stationnaire. En phase de latence, les cellules s’acclimatent à leur environnement, elles grossissent mais ne se divisent pas. Au cours de la phase exponentielle, les cellules se divisent rapidement jusqu’au doublement de la population. Un fois les nutriments épuisés, les cellules de levure entrent dans la phase stationnaire, pendant laquelle la division cellulaire ralentit et la population de cellules reste constante.
A l’aide de la courbe de croissance, le temps de doublement de la souche peut être calculé grâce à l’équation suivante: OD1 et OD2 représentent les mesures de densités optiques et T1 et T2 les temps entre les mesures. Le temps de doublement est défini comme le temps nécessaire à la population de cellules pour doubler. Effectuez le calcul entre deux valeurs de DO en phase exponentielle, par exemple entre les valeurs 0.2 et 0.5 comme illustré ici. Un temps de doublement d’environ 90 min doit être obtenu pour des levures de type sauvage.
La connaissance du temps de doublement est avantageuse car elle vous permet de planifier vos manipulations de la journée en conséquence.
Maintenant que nous avons présenté les principes de base de la courbe de croissance de la levure, poursuivons au laboratoire et effectuons une manipulation pour la préparation de culture de cellules de levure. Les principaux constituants des milieux de culture – également appelés nourriture pour levure – sont : l’extrait de levure, la peptone et une source de sucre. L’extrait de levure est constitué du contenu des cellules de levure, à l’exception de la paroi cellulaire, et fournit les acides aminés, les vitamines, les carbohydrates et autres nutriments nécessaires à la croissance. La peptone est dérivée de viande animale ou de lait et est la source principale d’acides aminés. Une source de sucre, généralement du glucose, est ajoutée pour fournir de l’énergie aux cellules en croissance.
Après la dissolution de l’extrait de levure et de la peptone dans l’eau, stérilisez le mélange dans un autoclave. Pour générer des boîtes de gélose, ajoutez de l’agar au milieu liquide et versez le mélange dans les boîtes de Pétri en le laissant solidifier à température ambiante. Ces plaques de gélose peuvent ensuite être utilisées lors de l’isolement de souches pour la culture de colonies de levure.
Maintenant que nos milieux de culture sont prêts, comment allons-nous cultiver ces petites créatures ? Avant tout, assurez-vous que tous les instruments, les solutions et les milieux de cultures sont stériles.
Ensuite, prenez une plaque de gélose pour l’ensemencement des cellules de levure. L’ensemencement en strie est le procédé d’étalement d’un liquide de culture de levure sur une plaque de gélose en utilisant un instrument stérile. Des colonies individuelles vont se former dans ces stries. Ces colonies sont issues d’une seule cellule de levure qui peut être prélevée afin d’obtenir une population génétique pure de cellules de levure. Une fois que les plaques sont ensemencées, retournez les et placez-les 2 à 3 jours dans un incubateur à 30 °C. C’est la température optimale pour la culture de la levure.
Une fois les colonies formées, inoculez les cellules de levure dans un petit volume de milieu de culture. Inoculer signifie ici prélever une seule colonie et l’ajouter au milieu en le mélangeant brièvement. Incubez la culture dans un agitateur orbital ou rotatif à 30 °C pendant 48 heures.
Pour de plus grandes cultures de cellules, vérifiez premièrement la DO à 600 nm de la culture âgée de 2 jours au spectrophotomètre. Faites les dilutions nécessaires pour commencer avec une DO entre 0.1 et 0.2. Après dilution des cellules, placez la fiole dans l’agitateur à 30°C et laissez pousser les cellules jusqu’à la DO souhaitée.
La prochaine étape importante après l’apprentissage de la culture des S. cerevisiae est la façon de les stocker pour une utilisation ultérieure. Les levures peuvent être conservées sur plaques de gélose à 4°C pendant 3 mois. Si toutefois vous souhaitez développer une culture fraîche, assurez-vous de tout d’abord réensemencer les cellules sur une nouvelle plaque avant l’inoculation.
Pour le stockage des souches de levures durant de longues périodes, transférer une partie aliquote dans des cryotubes contenant du glycérol. Les cellules peuvent être conservées à -80 °C pendant plusieurs années.
Maintenant que vous êtes un pro de la culture des cellules de levure, voyons comment nous pouvons utiliser ces techniques essentielles en recherche scientifique. Les cellules en phase stationnaire peuvent être utilisées pour l’étude des gènes qui régulent l’instabilité du génome d’ADN lors du vieillissement. Cette vidéo montre la collecte de cellules provenant d’une culture de trois jours. Les cellules sont ensemencées sur un milieu sélectif qui empêche le développement des cellules de levure normales. Seules les cellules ayant acquis une mutation peuvent former des colonies sur ces plaques. Le nombre de colonies sur les plaques est proportionnel au niveau d’instabilité génétique dans la culture.
Un autre exemple d’étude du vieillissement s’effectue par l’analyse du cycle de vie chronologique des cellules de levure. Le vieillissement chronologique signifie une perte de viabilité cellulaire durant une période donnée et peut être étudié en cultivant des cellules liquides comme illustré ici. Dans cette vidéo, le scientifique charge plusieurs cultures sur le spectrophotomètre afin de générer plusieurs courbes de croissance qui aideront à déterminer la viabilité cellulaire.
Les cellules de levure de type sauvage en phase exponentielle représentent des cellules normales et saines qui peuvent être utilisées pour l’étude des organites eucaryotes tels que le ribosome. Dans cette vidéo, vous pouvez voir le chargement de lysat cellulaire provenant de cellules en phase exponentielle, sur un gradient de saccharose. Les cellules sont ensuite centrifugées pour sédimenter les ribosomes et le profil de ribosome est obtenu par contrôle de l’absorbance.
Vous venez de regarder l’introduction à l’élevage et l’entretien de la Saccharomyces cerevisiae de JoVE. Dans ette vidéo, nous avons présenté la courbe de croissance de la levure, la culture de cellules et le stockage des souches de levures. Merci de votre attention et n’oubliez pas de recommander cette vidéo à un ami.
The important discoveries of cell cycle regulation, telomerase activity, and autophagy in Saccharomyces cerevisiae, have proven that this yeast species a valuable model organism for research. Yeast are easy to grow and yeast plasmids and strains are commercially available. Despite the relatively inexpensive requirements for culturing yeast, maintenance of this organism is critical for successful experiments. This video will give you an inside look in how to grow yeast cell cultures and maintain S. cerevisiae strains in laboratories.
In biology, growth curves represent the change in cell population over a period of time. In yeast, the growth curve is generated by plotting the optical density, or “OD”, of cell culture at 600 nm in the y axis and time on the x axis. Optical density or “absorbance” is the logarithmic ratio of the intensity of light entering the yeast cell suspension to the intensity passing through it. The OD at a specific wavelength of light is measured using a spectrophotometer.
When working with yeast, the growth curve of the yeast strain has to be generated by taking OD measurements at different time intervals. The yeast growth curve is divided into three major phases: lag, logarithmic, and stationary phase. During lag phase, cells are acclimating to the environment and are growing in size but are not dividing. In log phase, cells are actively dividing thus leading to cell doubling. Once available nutrients are depleted, yeast cells enter stationary phase, where cell division slows down and the cell population remains constant.
Using the growth curve, the doubling time of the strain can be calculated with the following equation: OD1 and OD2 represent optical density measurements, and T1 and T2 are the time between measurements. The doubling time is defined as the time required for a cell population to double in cell number. Calculate between two log phase OD values, for example, between values 0.2 and 0.5 as shown here. Wild type yeast should give a doubling time value of approximately 90 minutes.
Knowing the doubling time is beneficial since it will allow you to plan your experiments accordingly throughout the day.
Now that we have covered the nuts and bolts of the yeast growth curve, let’s progress onto the laboratory and do some hands on preparation to grow yeast cells. The major components of rich growth media — AKA Yeast food – are: yeast extract, peptone, and a sugar source. Yeast extract contains yeast cell contents, excluding the cell wall, and provides amino acids, vitamins, carbohydrates, and other nutrients required for growth. Peptone is derived from animal meat or milk and is the main source of amino acids in yeast media. A sugar source, typically glucose, is added as it provides energy to the growing cells.
After dissolving yeast extract and peptone in water, sterilize the mixture using an autoclave. To make yeast media plates, add agar to the liquid media, and pour the mixture into plates, allowing it to solidify at room temperature. These plates can be used when streaking strains to grow yeast colonies.
Now that we have all our media prepared, how do we grow cultures of these critters from scratch? First and foremost, make sure all instrument, solutions, and media are sterile.
Next, obtain a plate to streak out yeast cells. No not that kind of streaking! Streaking is the process of spreading liquid yeast cultures onto agar plate using a sterile instrument, like you see here. Around the “streaks” individual colonies will form, which are derived from a single yeast cell, that can be picked, in order to obtain a pure genetic population of yeast cells. Once plates are streaked, invert the plate and place it in a 30 °C incubator for 2 to 3 days. This is the optimal temperature for yeast growth.
Once colonies have formed, inoculate the yeast cells in a small volume of growth media. Inoculate here means picking a single colony and introducing it to the media by mixing it briefly. Incubate the culture in a 30 °C shaker or rotator for 48 hours.
To grow larger cultures of cells, first check the OD600 of the 2 day-old yeast culture using a spectrophotometer. Make the appropriate dilutions so that the starting OD is approximately 0.1-0.2. After diluting the cells, place the flask in a 30 °C shaker and grow the cells up to the desired OD.
The next important lesson after learning how to grow S. cerevisiae is how to store them for future use. Yeast grown on plates can be stored at 4 °C up to 3 months. However, if you want to grow a fresh culture, make sure you re-streak the cells on a fresh plate first before inoculating.
To store stocks of yeast strains for long periods, aliquot the cells in cryovials containing glycerol. Cells can then be stored at -80 °C, where they can remain up to several years.
Now that you’re a pro when it comes to growing yeast cells, let’s take a look at how we can apply these essential techniques in scientific research. Cells in the stationary phase can be used to study genes that regulate genome DNA instability during aging. This video clip shows the collection of cells from a three-day-old culture. They are plated on selective media that prevents normal yeast cells from growing. Only cells that have acquired a mutation can form colonies on these plates. The number of colonies on the plates is proportional to the level of genomic instability in the culture.
Another example of studying aging is by analyzing the chronological life span of yeast cells. Chronological aging denotes loss of cell viability over a period of time and can be studied by growing liquid cultures as shown here. In this video, the scientist is loading various cultures onto the spec in order to generate growth curves, which will help to determine cell viability.
Wild type yeast cells in log phase represent healthy, normal cells and can be used to study eukaryotic organelles, such as the ribosome. In this video, you can see the loading of the cell lysate from cells collected in log phase to a sucrose gradient. Next, cells are spun to sediment ribosomes and an absorbance monitor is used to generate the ribosome profile.
You’ve just watched JoVE’s introduction to husbandry and maintenance of Saccharomyces cerevisiae. In this video we reviewed the yeast growth curve, demonstrated how to grow cell cultures, and showed you how to maintain yeast strains. Thanks for watching, and don’t forget to recommend this video to a bud.
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