In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Le but de la procédure suivante est d’étudier les changements dynamiques longitudinaux des terminaisons nerveuses de la peau après une lésion sélective. Pour cela, nous anesthésions une souris transgénique YFP et la plaçons sur le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Placez la patte arrière sur un matériau d’emballage en plastique et placez une goutte d’eau sur la peau pour obtenir un meilleur couplage optique.

Couvrez le poteau arrière avec une lamelle en verre solidement fixée à une barre métallique pour plus de stabilité. Mettez une goutte d’eau pour l’objectif d’immersion dans l’eau et effectuez deux fois sur l’imagerie microscopique. Combiné à une lésion des terminaisons nerveuses induite par le laser, une variété de conditions pathologiques affectent la dynamique des intégrations cutanées.

L’une des meilleures façons de vérifier cet effet est de visualiser les changements pathologiques dans les terminaisons nerveuses cutanées directement dans la peau d’un animal vivant. Vivo à la photomicroscopie est un excellent outil pour cette approche. Avant l’imagerie, pesez la souris et induisez une anesthésie en injectant de la kétamine à la concentration de 80 microgrammes par gramme de poids corporel en xylazine.

À la concentration de 10 microgrammes par gramme de poids corporel. Vérifiez l’anesthésie en pinçant légèrement le membre postérieur de la souris. Utilisez des gouttes oculaires visqueuses pour prévenir la déshydratation des yeux de la souris.

Lors de l’imagerie pour la stabilisation, nous utilisons un fixateur métallique de conception exclusive avec un anneau. Mettez la petite goutte de colle sur l’anneau et étalez-la uniformément. Fixez ensuite le verre de protection à l’anneau métallique.

Pour faciliter une couverture uniforme de la peau de la souris pour l’imagerie, nous utilisons un microscope à deux photons disponible dans le commerce et équipé d’une platine motorisée. Nous avons fixé l’anneau métallique avec le verre de protection vers le bas à une barre métallique solide solidement fixée à la platine du microscope. Nous maintenons la température corporelle de l’animal à 37 degrés Celsius en le maintenant sur un coussin chauffant.

Nettoyez le poteau arrière avec de l’éthanol. Ajoutez une goutte d’eau à la surface de la peau pour l’immersion. Placez le poteau Hein entre la lamelle en verre et le matériau d’emballage en plastique.

Ajustez le matériau pour obtenir le meilleur positionnement de la patte arrière. Ajoutez une goutte d’eau sur le dessus du verre pour assurer l’immersion de l’objectif. Conduisez la scène avec une patte arrière fixe sous l’objectif.

Tout d’abord, utilisez une lampe à fluorescence épi pour trouver la zone appropriée pour l’acquisition de données. Localisez la terminaison nerveuse d’intérêt et notez ses coordonnées pour des mesures répétées dans la même zone. Une fois que nous nous concentrons sur le nerf approprié, nous pouvons passer en mode à deux photons.

Réglez une tension appropriée sur les tubes photomultiplicateurs. Sélectionnez la taille de l’image, généralement comprise entre 500 et 800 pixels, et définissez la longueur d’onde d’excitation. Par exemple, à 915 nanomètres pour YFP.

Après avoir acquis la pile d’images, passez à la procédure de lésion. Nous utilisons la routine de blanchiment disponible dans le progiciel Olympus et réglons le temps d’exposition entre 100 millisecondes et une seconde. En fonction des propriétés optiques de chaque région particulière de la peau.

Trouvez un endroit où vous voulez faire la lésion et activez la routine de blanchiment. Après la lésion, suivez les changements à l’aide du time-lapse en deux fois sur l’imagerie sur des minutes, des heures ou des jours. Habituellement, la durée de la séance d’image est d’environ une heure, mais elle peut être facilement ajustée en fonction de la tâche.

Après les mesures, nous éloignons la platine avec la souris de l’objectif. Amenez la souris dans une boîte de récupération réglée à la température de 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle se réveille. La procédure d’imagerie peut ensuite être répétée sur une plage de jours, voire de mois.

Au cours d’une analyse hors ligne, il est parfois nécessaire d’UNIX le signal d’intérêt, tel que la fluorescence YFP à partir de la fluorescence d’ordre superposé. Nous effectuons le démixage spectral à l’aide du logiciel Image J. Ouvrez la pile d’images et divisez les canaux.

Trouvez la zone où la terminaison nerveuse se distingue clairement des cheveux ou des autres structures. Vous voulez l’Unix à partir de. Utilisez le plugin appelé spectral and mixing pour calculer les paramètres de la matrice de démixage.

Tout d’abord, trouvez la zone sans signal pour mesurer le niveau de bruit de fond. Ensuite, tracez soigneusement la partie des cheveux qui peut être distinguée des terminaisons nerveuses. Plus vous faites la sélection avec précision, meilleure sera la séparation.

Ensuite, tracez précisément une région de la terminaison nerveuse. Enfin, utilisez le même plugin et appliquez la matrice obtenue pour démélanger les données. Les nerfs des cheveux devraient maintenant apparaître dans deux canaux différents.

En conséquence, nous pouvons reconstruire les structures tridimensionnelles des fibres nerveuses et suivre les changements au fil du temps. Vous pouvez utiliser différentes échelles de temps allant de quelques minutes à plusieurs jours, voire plusieurs mois. De plus, on pourrait utiliser d’autres lignées de souris transgéniques, comme, par exemple, celles exprimant un marqueur fluorescent dans les mitochondries.

In vivo, la multi-photomicroscopie des structures superficielles combinée au modèle transgénique approprié est un outil puissant pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques et la peau. L’approche méthodologique que nous avons démontrée dans ce protocole vidéo révèle quelques conseils essentiels qui permettent d’effectuer des manipulations d’imagerie microscopique et microchirurgicales multiples sur les nerfs périphériques dans un schéma de rongeur de manière simple, fiable et non invasive. Étant donné que cette méthode pourrait être facilement appliquée à une variété de modèles fluorescents transgéniques disponibles, nous espérons que cette vidéo aidera d’autres chercheurs qui effectuent des expériences d’imagerie superficielle.

Merci de votre attention et bonne chance dans vos expériences.I.