Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d'Intact poisson zèbre adulte

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des enregistrements in vivo de l’activité neuronale dans le cerveau de poissons-zèbres adultes intacts. Ceci est accompli en obtenant d’abord un immobilisateur, un poisson zèbre adulte par l’application en bain de Trica Methyls sulfonate. La deuxième étape consiste à intuber le poisson zèbre immobilisé.

Ensuite, une craniotomie est réalisée sous anesthésie trica pour permettre l’accès au cerveau. La dernière étape consiste à positionner une électrode primaire dans la fenêtre de craniotomie, ce qui permet d’enregistrer l’activité cérébrale extracellulaire. Ultimement in vivo.

L’électrophysiologie chez le poisson-zèbre adulte peut être utilisée pour montrer comment différents composés pharmacologiques ou mutations génétiques peuvent entraîner des altérations de l’activité neurologique native du poisson-zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement et en neurobiologie sur la façon dont les changements dans la structure du cerveau peuvent affecter les changements dans l’activité neuronale, à la fois dans le développement normal et dans le cas d’une mutation génétique. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal à le faire, car il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne retirer qu’une petite partie de la plaque osseuse recouvrant la tête sans endommager le tissu cérébral.

La canule d’intubation facilite l’introduction du liquide dans le poisson. Cette configuration offre à la fois souplesse et fermeté pour positionner au mieux la canule dans la bouche de l’animal. Pour cette configuration, retirez une section de 1,5 centimètre de l’extrémité large d’une pointe de pipette P 200 à l’aide d’une paire de ciseaux ou d’une lame de rasoir.

Ensuite, insérez un morceau de tube de six centimètres sur un millimètre dans un réducteur. Insérez ensuite la pointe de pipette modifiée dans une courte partie d’un tube d’un huitième de pouce de diamètre. La canule peut ensuite être insérée dans la pointe de la pipette à l’aide du tube pour maintenir la pointe de la pipette en position avec le verrou de leurre.

Avant l’expérience, j’ai rincé une installation de profusion avec de l’eau d’habitat, en veillant à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de solution de trica 630 micromolaires à la configuration de perfusion de craniotomie, et laissez deux millilitres de celle-ci passer à travers la tubulure pour assurer l’administration de trica à l’animal lors du début de la profusion. Pour la configuration de profusion principale, ajoutez 50 millilitres d’eau d’habitat dans le premier tube.

Ajoutez ensuite tous les composés expérimentaux souhaités dans chacun des tubes restants. Après cela, placez une configuration de canule dans le petit trou de la base d’intubation, tordez une bande d’un pouce de large de lingette Kim en une spirale serrée et insérez-la dans le tube de drainage de sorte que la lingette Kim s’étende aux deux extrémités. Ce tissu servira de mèche pour éliminer le liquide perfusé et pour prévenir l’accumulation de liquide dans la base d’intubation qui pourrait interférer avec l’enregistrement électrophysiologique.

Ensuite, insérez une extrémité du tube dans le grand trou de la boîte de Pétri, permettant à l’extrémité inférieure de s’étendre dans une boîte inerte suffisamment grande pour recueillir tous les déchets de profusion. Cette parabole servira de réservoir d’écoulement pour la configuration. Positionnez ensuite le tissu de manière à ce qu’une extrémité se trouve près de la région abdominale de l’animal et que l’extension inférieure puisse s’égoutter dans le plat.

Placez cette base d’intubation terminée près du microscope de dissection. Connectez ensuite le lulock de la canule à la tubulure de profusion trican. Dans cette procédure, ajoutez une solution de trica micromolaire de 630 à une boîte de Pétri de 15 x 60 millimètres jusqu’aux trois quarts.

Ensuite, pesez le plat des champs. Celui-ci sera utilisé pour immobiliser l’animal afin qu’une anesthésie supplémentaire puisse être injectée dans le péritonéal. Plongez maintenant l’animal dans le plat contenant le trica et pesez à nouveau le plat.

Calculez ensuite le poids du poisson en soustrayant le poids du plat rempli du poids total. Laissez l’animal rester dans la solution trica jusqu’à ce qu’il soit calme et que la plupart des mouvements aient cessé. Pendant que le poisson est immergé dans la solution de trica, utilisez une seringue NFI contenant une aiguille de calibre 34 pour prélever suffisamment de bromure de pantonium de sorte qu’il y ait un microgramme par gramme de poids de poisson.

Une fois que le poisson est calmé, utilisez une paire de pinces larges pour transférer le poisson par la queue sur une éponge pré-humidifiée et positionnez-le latéralement. Ensuite, placez une éponge et le poisson sous le microscope de dissection. Tenez la face dorsale du poisson à l’aide d’un bâtonnet de popsicle.

Administrez ensuite le pan keon bromure interpéritonéal. Utilisez maintenant des pinces fines. Saisissez le poisson par la mâchoire inférieure et transférez rapidement l’animal à la base d’intubation.

Positionnez la face dorsale de l’animal vers le haut sur la forme de cire de manière à ce que la canule d’un millimètre puisse être insérée dans la bouche. Ensuite, utilisez la pince fine pour manœuvrer le poisson et ouvrez la bouche autour de la canule. Dans notre configuration.

Une butée a été conçue dans la base, permettant d’insérer la canule à trois millimètres dans la bouche du poisson. Une fois qu’il est en position, allumez le tube de perfusion alimenté par gravité contenant le trica. Ensuite, coupez une section de trois centimètres carrés de tissu d’essuyage Kim et mariez-la avec de l’eau d’habitat.

Placez le tissu sur l’animal pour éviter la dessiccation. Sous le microscope de dissection, le poisson est préparé et attend que la craniotomie soit effectuée. Cette zone ressemble à une plaque osseuse sombre qui se trouve derrière l’œil.

Ensuite, insérez une lame de la fourgonnette de ciseaux au bord de la plaque et poussez-la avec suffisamment de force pour pénétrer dans l’os sans percer le cerveau. Fermez ensuite les ciseaux pour couper l’os. Après cela, retirez le morceau d’os pour l’enregistrement électrophysiologique.

Arrêtez l’intubation. Arrêtez le robinet et déconnectez rapidement le verrou de leurre reliant la base d’intubation au goutte-à-goutte trica. Déplacez le dispositif d’intubation intact vers le microscope d’électrophysiologie et connectez-le au système de perfusion.

Allumez l’habitat, arrosez et perfuser à raison d’un millilitre par minute pendant environ une heure. Afin de laver le trica à l’aide d’un micromanipulateur, positionnez l’électrode secondaire de manière à ce que la pointe de l’électrode puisse être insérée dans la narine de l’animal ou dans le creux sous la mâchoire supérieure. Par la suite, insérez l’aiguille de l’électrode primaire dans l’ouverture de la craniotomie.

Insérez ensuite l’aiguille dans le tissu de manière à ce que la pointe soit positionnée assez superficiellement à l’intérieur du ventre optique. Des positions plus profondes de l’électrode peuvent entraîner un petit signal électrique pour la collecte de données en mode sans espace à une fréquence d’échantillonnage de 5 000 hertz, ainsi qu’un filtre passe-bas de 0,1 kilohertz et un filtre passe-haut d’un hertz. Commencer l’enregistrement de l’activité électrophysiologique lorsque l’eau de l’habitat a perfusé pendant au moins 45 minutes.

Enregistrer une base de référence de l’activité native pendant au moins 15 minutes avant l’ajout de médicaments expérimentaux. L’activité neurologique native du poisson-zèbre adulte a été suivie dans cette expérience, cette figure montre l’activité de base spontanée du tum optique avec une petite amplitude d’environ deux à 10 millivolts pendant toute la durée de l’enregistrement. Suite à l’introduction de 15 millimolaires PTZ dans le système, des décharges épileptiques spontanées ont commencé à se développer en cinq minutes.

L’exposition continue au PTZ a conduit à un schéma constant allant jusqu’à 15 millivolts, des décharges de grande amplitude, suivies de rafales d’activité plus petites et plus fréquentes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’être patient et de prendre son temps lors de la manipulation de l’animal et de la réalisation de la craniotomie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’obtenir des enregistrements in vivo de l’activité neuronale dans le cerveau d’un poisson zèbre adulte intact.

Ceci est accompli en utilisant un système de profusion et en effectuant une craniotomie sur l’animal immobilisé.