Name: Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez comment le virus gamma herpès 68 détourne la protéine Mavs pour supprimer la production de cytokines antivirales chez la souris. Cette méthode révèle les mécanismes d'évasion immunitaire innée.

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Souris, de type sauvage (Mavs + / +) et knock-out (Mavs - / -) de type sauvage (Mavs + / +) et knock-out (Mavs - - /) FAE ont été aimablement fournies par le Dr J. Zhijian Chen (Université de Texas Southwestern Medical Center) 13. Cette publication est basée sur les travaux financés par des subventions du NIH (R01 CA134241 et R01 DE021445) et l&#39;American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).

Déclaration éthique: Tous les travaux de l&#39;animal a été réalisé sous stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l&#39;Université de Californie du Sud. Une. Cytokine expression génique par quantitative PCR en temps réel et la sécrétion par ELISA chez des souris infectées par γHV68 <ol><li> Anesthésier, 6-8 semaines d&#39;âge C57BL / 6 (B6) littermates genre identifié (8-12 souris / groupe) par injection intrapéritonéale de 1,5 mg de ketamine/0.12 mg de xylazine, et inoculer par voie intranasale avec 40 PFU de γHV68 dans 40 pi (infection détaillé dans Dong Feng et 11). A différents moments après l&#39;infection, euthanasier les souris en utilisant inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale. </li><li> Ouvrez le coffre avec une coupe latérale gauche le long de la sternum et couper à travers les côtes avec des ciseaux pointus. Recueillir les tissus pulmonaires. </li><li> Recueillir la moitié du tissu pulmonaire (lobe gauche) dans 1,5 ml tubes à bouchon à vis stériles contenant 500 ul de 1,0 mm perles zircon / de silice. Ajouter 1 ml de DMEM sans sérum froid dans le tube et homogénéiser les tissus pulmonaires de bourrelet battement pendant 30 sec. Refroidir les tubes sur de la glace pendant 2 min et répéter ce processus une fois. </li><li> Centrifuger les tubes (15 000 x g pendant 10 min) à 4 ° C, recueillir le surnageant et à mesurer la production de cytokine tels que décrits ci-dessous. </li><li> Mesurer cytokines aide disponibles dans le commerce cytokines kits ELISA selon les instructions du fabricant. </li><li> Recueillir l&#39;autre moitié du tissu pulmonaire (lobe droit) dans un autre tube contenant de perles et ajouter 1 ml TRIzol. Homogénéiser et recueillir le surnageant, comme décrit dans l&#39;étape 1.3 et de l&#39;ARN extrait selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration d&#39;ARN par des lectures de l&#39;absorbance à 260 et 280 nm. </li&gt; <li> Préparer l&#39;ADNc avec 1 ug d&#39;ARN total et la transcriptase inverse selon les instructions de la fabrication (le volume final était de 20 pl au total). Diluer ADNc 50 fois à la DNAse et de l&#39;eau sans RNAse et effectuer la PCR quantitative en temps réel. </li><li> Effectuer le programme sur une machine quantitative PCR en temps réel. Chaque réaction contient 0,5 ul d&#39;une paire d&#39;amorces spécifiques d&#39;un gène ou d&#39;amorces de contrôle de GAPDH (la concentration de travail des amorces étaient de 10 uM, CE 500 nM de chaque amorce), 5 pi de mélange maître SYBR et 4 pl de la dilution ADNc. Calculer ΔΔCt pour déterminer la quantité relative de transcrits d&#39;ARNm de cytokines antivirales. </li></ol> 2. MEF infection cellulaire et des cytokines quantification par ELISA et qRT-PCR <ol><li> Cultivez Mavs + / + et Mavs - / - cellules MEF à sous-confluence (environ 80%) densité avant l&#39;étalement des cellules. </li><li> Diviser les cellules MEF en 12 nousoutes les plaques à 100 000 cellules / puits (la densité cellulaire sera d&#39;environ 70% le deuxième jour). Effectuer infection γHV68 en triple, avec une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 5 à 10 pour synchroniser et optimiser l&#39;induction de cytokines. </li><li> Préparer γHV68 suspension dans du milieu complet DMEM contenant la quantité appropriée de virus (1 ml pour chaque puits). </li><li> Retirer moyen et ajouter γHV68 suspension contenant les cellules MEF. </li><li> Placer la plaque dans le tissu incubateur de culture, le rock toutes les 30 minutes, et permettre à un total de 2 heures d&#39;incubation. </li><li> Retirez milieu contenant γHV68, laver une fois avec du PBS, et les remplacer par du DMEM complet frais. </li><li> À divers moments après l&#39;infection, le milieu de la récolte dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Laver les cellules avec du PBS froid et de recueillir les cellules infectées par digestion à la trypsine. </li><li> Mesurer cytokines antivirales dans un milieu tel que décrit dans l&#39;étape 1.5. </li><li> Extraire l&#39;ARN, l&#39;ADNc de préparer et d&#39;effectuer qRT-PCR pour déterminer l&#39;expression des gènes de cytokines antiviralescomme décrit dans les étapes 1.5 à 1.7. </li></ol> 3. La production de lentivirus, infection, et la génération de lignées cellulaires stables <ol><li> Division des cellules 293T Un jour avant la transfection et permettent aux cellules d&#39;atteindre environ 40% de confluence au moment de la transfection. </li><li> Transfecter de 10 cm de cellules 293T avec les plasmides d&#39;emballage (1,2 ug de pVSV-G et 6 pg de pDR8.9) et 7,2 ug de PCDH-drapeau-MAVS ou contrôle PCDH par précipitation au phosphate de calcium. </li><li> Remplacer moyenne de 6 à 8 heures après la transfection avec du DMEM complet frais. </li><li> A 72 heures après la transfection, un milieu contenant du lentivirus collecter, centrifuger à 4000 g pendant 15 min, et le filtre à membrane de 0,22 um. Pour augmenter le titre lentivirus, nous centrifuger le milieu contenant le virus à 110 000 g pendant 2,5 heures à 4 ° C. Remettre en suspension avec précaution le culot viral dans un petit volume de milieu d&#39;intérêt. </li><li> Mavs de semences - / - cellules MEF ou d&#39;autres cellules knock-out MEF un jour Before infection dans des plaques à 6 puits à ~ 30-40% de confluence. </li><li> Infecter les cellules avec 1 ml MEF lentivirus et 2 ml de DMEM complet frais, additionné de polybrène à une concentration finale de 10 pg / ml. </li><li> Centrifuger la plaque à 500 x g à 30 ° C pendant 30 min et à transférer la plaque à un incubateur de culture tissulaire. </li><li> Remplacer moyenne à 6 heures après l&#39;infection avec du DMEM complet frais. </li><li> Fractionner les cellules MEF à 24 heures après l&#39;infection et ajouter puromycine à une concentration finale de 1 pg / ml à 48 heures après l&#39;infection pour sélectionner les cellules exprimant de façon stable MAVS. </li><li> Maintenir les cellules MEF dans un milieu contenant la puromycine et vérifier l&#39;expression des protéines par immunoblot avec des anticorps correspondants. </li><li> Les cellules peuvent être utilisées pour l&#39;infection virale, l&#39;expression des gènes des cytokines et des expériences de sécrétion tel que décrit dans le protocole 2. </li></ol>

<ol><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-1%2C+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li>
<li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MAVS%2C+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li>
<li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li>
<li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li>
<li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection%3A+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li>
<li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li>
<li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
<li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Évasion immunitaire virale est l&#39;une des interactions les plus dynamiques et les plus fascinants d&#39;interface infraction virale et défense de l&#39;hôte 9. Les composants de l&#39;immunité innée de l&#39;hôte sont structurés de telle sorte que la transduction du signal est effectivement lancé et fidèlement transmis. La délimitation de la hiérarchie et de la réglementation des cascades de signalisation est un sujet prééminent de l&#39;immunité innée. Ici, nous introduisons un protocole pour identifier l...

Des études récentes ont souligné les cascades de signalisation dans l&#39;ensemble de montage réponses immunitaires innées de l&#39;hôte. Résidant dans des compartiments distincts, les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) de détecter des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) d&#39;origines diverses pour déclencher immunitaire inné de signalisation 1. Le gène induite par l&#39;acide rétinoïque I (RIG-I) et de l&#39;antigène de différenciation des mélanomes (5 protéines de MDA5) sont des capteurs qui reconnaissent cytosoliques espèces d&#39;ARN avec des caractéristiques structurales spécifiques 2. Lors de l&#39;activation, RIG-I interagit avec son MAVS aval (également connu sous le IPS-1, VISA, et CARDIF) adaptateur qui, à son tour, active la IKK (IKKαβγ) et kinase liée IKK (TBK1 et IKKε, également connu sous le IKKi ) complexes 3-6. Kinases activées phosphorylent immunitaires innées des régulateurs clés de l&#39;expression de gènes, y compris les facteurs de transcription et leurs inhibiteurs, et permettent l&#39;activation transcriptionnelle de gènes antiviraux de l&#39;hôte (par exemple IL6, TNF &amp; #945;, CCL5, et IFNß). Ces cascades de signalisation constituent les réponses innées intrinsèques puissants immunitaires qui établissent un état anti-microbienne de limiter la propagation de l&#39;agent pathogène au cours des premiers stades de l&#39;infection. Murine γHV68 est étroitement liée à KSHV oncogène humain et EBV. Ainsi, l&#39;infection de souris γHV68 fournit un petit modèle animal traitable à examiner la réponse immunitaire de l&#39;hôte à l&#39;infection par le virus de l&#39;herpès gamma in vivo 7. Utilisation γHV68, notre laboratoire a découvert une stratégie complexe dans lequel γHV68 détourne accueillir signalisation immunitaire innée à permettre à l&#39;infection virale. D&#39;une part, γHV68 active la voie MAVS-IKKß, de promouvoir l&#39;activation de la transcription virale via diriger IKKß activé pour phosphoryler la réplication transactivateur (RTA), la clé virale du facteur de transcription pour la réplication γHV68 8. D&#39;autre part, la phosphorylation médiée par amorce IKKß RelA pour la dégradation et la duréeInates activation de NFkB 9. En tant que tel, l&#39;infection γHV68 évite efficacement la production de cytokines antiviral. Fait intéressant, un dépistage utilisant une bibliothèque d&#39;expression de γHV68 identifié RTA comme une ligase E3 pour induire la dégradation des RelA et abroger activation de NFkB 10. Ces résultats dévoilent une stratégie d&#39;évasion immunitaire complexe dans lequel les événements de signalisation en amont immunitaires sont mobilisées par γHV68 à nier l&#39;ultime production de cytokines antiviral. Ici, nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez des souris infectées avec γHV68 la fois in vivo et ex viv o. Dans le protocole, nous explorons encore la &quot;reconstitué&quot; expression des composants de l&#39;immunité innée dans les fibroblastes embryonnaires knock-out par transduction lentivirus, qui met en évidence la fonction des molécules immunitaires innées spécifiques dans la régulation de la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être facilement adaptée à d&#39;autres virusession et les voies de signalisation.

<table><tbody><tr><td>Kit ELISA souris CCL5</td><td><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> R&amp;amp;D Systems</a></td><td>DY478</td><td></td></tr><tr><td>Billes de zircone/silice de 1,0 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=15596018" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Invitrogen</a></td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse SuperScript II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Amorces quantitatives de PCR en temps réel pour CCL5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection innate immune signalisation evasion virale de la production de cytokines

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

En réponse à une infection virale, l&#39;hôte une réponse immunitaire innée est activé pour réguler à la hausse l&#39;expression des gènes et la production de cytokines antivirales. Inversement, les virus ont développé des stratégies complexes pour échapper à exploiter et signalisation immunitaire de l&#39;hôte pour la survie et la propagation. Évasion immunitaire virale, entraînant défense de l&#39;hôte et l&#39;évasion virale, fournit l&#39;une des interfaces les plus fascinants et les plus dynamiques de discerner l&#39;interaction hôte-virus. Ces études progresser notre compréhension de la régulation immunitaire innée et ouvrent notre façon de développer de nouveaux traitements antiviraux. Murin γHV68 est un agent pathogène naturel des rongeurs murins. γHV68 infection de souris fournit un modèle animal docile pour examiner la réponse antivirale de KSHV humaine et EBV qui perturbation des interactions in vivo dans virus-hôte n&#39;est pas applicable. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être adapté à d&#39;autres virutilise et les voies de signalisation. Récemment, nous avons découvert que γHV68 détourne MAVS et IKKß, innés principaux composants de signalisation en aval de l&#39;immunitaires cytosolique RIG-I et MDA5, d&#39;abroger l&#39;activation de NFkB et la production de cytokines antivirales. Plus précisément, l&#39;infection active γHV68 IKKß et que IKKß activée phosphoryle RelA à accélérer la dégradation de RelA. En tant que tel, γ HV68 découple efficacement l&#39;activation de NFkB de son amont IKKß activé, la négation de l&#39;expression antiviral de gène de cytokine. Cette étude met en lumière une stratégie complexe de sorte que l&#39;activation immunitaire innée en amont est interceptée par un agent pathogène viral d&#39;annuler l&#39;activation de la transcription en aval immédiat et soustraire la production de cytokines antivirales.

Trois figures représentatives sont présentés ici, y compris la production de cytokines dans le poumon de Mavs γHV68 infectés + / + et Mavs-/ - souris, la sécrétion de cytokines et l&#39;expression des gènes niveau de Mavs + / + et Mavs γHV68 infectés - / - MEF, et les niveaux d&#39;ARNm de cytokines Mavs γHV68 infectés - / - FAE &quot;reconstitués&quot; avec MAVS. Ces expériences représentatives utilisent des souris knock...

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l&#39;herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l&#39;herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d&#39;Epstein-Barr (EBV). L&#39;utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo. &quot;Reconstitution&quot; de l&#39;expression des composants immunitaires innées à élimination directe des fibroblastes embryonnaires de transduction lentiviral, nous Pinpoint en outre des molécules immunitaires innées spécifiques et disséquer les événements de signalisation clés qui régulent différemment la production de cytokines antiviral.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de disséquer les principales molécules immunitaires innées de l'hôte régulant la production de cytokines antivirales après injection du virus gamma herpès 68 ou gamma HV 68. Ceci est réalisé en comparant les cytokines antivirales sécrétées par des souris de type sauvage Mavs et des souris invalidées pour Mavs après injection de gamma HV 68. La deuxième étape consiste à quantifier les cytokines produites par des cellules MEF de type sauvage Mavs et des cellules MEF invalidées pour Mavs après infection par le gamma HV 68, ce qui confirme que Mavs est utilisé pour supprimer la sécrétion de cytokines antivirales. L'étape suivante consiste à réintroduire Mavs dans des cellules MEF invalidées pour Mavs afin d'évaluer si les niveaux d'expression des cytokines sont restaurés par Mavs exogène. Les résultats obtenus montrent que le gamma HV 68 s'approprie Mavs, un composant clé de la signalisation immunitaire innée, afin d'abolir la production de cytokines antivirales in vivo et ex vivo, sur la base d'analyses par immunotransfert, ELISA et qRT-PCR réalisées sur des souris Mavs de type sauvage et invalidées ainsi que sur les cellules MEF correspondantes.Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l'immunité innée, telles que la réponse immunitaire innée de l'hôte lors d'une infection par un gammaherpèsvirus. La procédure sera démontrée par Lining Zhu, un postdoctorant du laboratoire du Dr Pinghui Feng. Inoculez par voie intranasale les souris anesthésiées C57-black-six avec 40 microlitres contenant 40 unités formant des plaques du pathogène murin naturel, le virus gamma herpès 68. Après l’euthanasie des souris aux points temporels expérimentaux post-infection, ouvrez la cage thoracique par une incision latérale gauche le long du sternum, sectionnez les côtes à l’aide de ciseaux pointus et prélèvez les tissus pulmonaires.Placer le lobe gauche dans un tube stérile de 1,5 millilitre à visser contenant 500 microlitres de billes de zircone-silice de 1,0 millimètre. Ajouter un millilitre de DMEM sans sérum et froid, puis homogénéiser le tissu pulmonaire par battement sur billes pendant 30 secondes.Refroidissez les tubes sur de la glace pendant deux minutes et répétez une fois le processus de fragmentation par billes. Ensuite, centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius et récupérez le surnageant. Mesurez maintenant les cytokines souhaitées à l'aide de kits ELISA commerciaux pour cytokines, conformément aux instructions du fabricant.Ensuite, placez le lobe droit du tissu pulmonaire dans un autre tube contenant des billes et ajoutez un millilitre de Trizol. Homogénéisez et récupérez le surnageant comme décrit précédemment. Puis, extrayez l'ARN selon les instructions du fabricant. Pour déterminer la concentration en ARN, mesurez les absorbances à 260 et 280 nanomètres. Ensuite, effectuez une réaction de transcription inverse avec un microgramme de matrices d'ARN total dans un volume final total de 20 microlitres. Pour la PCR quantitative en temps réel, diluez l'ADNc obtenu 50 fois dans de l'eau exempte d'ADN et d'ARN. Pour chaque réaction, ajoutez 0,5 microlitre d'une paire d'amorces spécifiques du gène ou de contrôle, cinq microlitres du mélange maître sybr et quatre microlitres d'ADNc dilué. Calculez les cycles seuils afin de déterminer la quantité relative de transcrits d'ARNm de cytokines antivirales sélectionnées.Incubez les fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage et invalidés jusqu'à une confluence de 80 %. Répartissez les cellules MEF dans des plaques de 12 puits à raison de 100 000 cellules par puits. Pour synchroniser et maximiser l'induction des cytokines. Préparez un stock de travail de virus gamma-herpès pour infecter les cellules en triple exemplaire avec une multiplicité d'infection comprise entre cinq et dix.Retirez maintenant le milieu et ajoutez la suspension contenant le gamma HV 68 aux cellules MEF. Placez les plaques dans un incubateur de culture tissulaire en les agitant doucement toutes les 30 minutes pendant une incubation de deux heures. Ensuite, retirez le milieu contenant le gamma HV 68. Lavez les cellules une fois avec du PBS, puis ajoutez du DMEM complet frais à différents points temporels après l'infection, et récupérez le milieu dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre. Lavez les cellules avec du PBS froid et récoltez les cellules infectées par digestion à la trypsine.Mesurez les cytokines antivirales dans le milieu par ELISA, comme indiqué précédemment. Extrayez également l'ARN, préparez l'ADNc et effectuez une qRT-PCR afin de déterminer le profil d'expression génique des cytokines antivirales, comme indiqué précédemment. Séparer les cellules 293T confluentes un jour avant la transfection et laisser les cellules atteindre une confluence de 40 % au moment de la transfection. Transfecter les cellules 293T avec les plasmides en utilisant la méthode de précipitation par phosphate de calcium. Six à huit heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM complet frais. Soixante-douze heures après la transfection, récupérer le milieu contenant le lentivirus. Centrifuger à 4 000 g pendant 15 minutes et filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,22 micromètre.Ensuite, centrifuger le milieu contenant à 110 000 g pendant deux heures et demie à quatre degrés Celsius. Redisperser soigneusement les culots viraux dans un petit volume du milieu d'intérêt. Ensuite, infecter les cellules MEF de type knock-out avec un millilitre de lentivirus et deux millilitres de DMEM complet frais supplémenté en polybrene. Centrifuger les plaques à 500 g à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis transférer les cellules dans un incubateur de culture tissulaire. Six heures après l'infection, remplacer le milieu par du DMEM complet frais. Diviser les cellules MEF infectées 24 heures après l'infection et, 48 heures après l'infection, ajouter de la puromycine à une concentration finale de un microgramme par millilitre afin de sélectionner les cellules exprimant de façon stable la construction virale.Entretenir les cellules MEF dans un milieu contenant de la puromycine et vérifier l'expression protéique par immunotransfert à l'aide d'anticorps spécifiques. Ces cellules peuvent désormais être utilisées pour des expériences d'infection virale, d'expression génique des cytokines et de sécrétion, comme indiqué précédemment.Le gène MAVS code pour une protéine mitochondriale de signalisation antivirale qui joue un rôle clé dans l'immunité virale. Ces résultats montrent que l'infection par le virus gamma HV 68 chez des souris invalidées pour Mavs conduit à une production significativement plus élevée de CCL-5 in vivo. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont ensuite été utilisés pour étudier le mécanisme de régulation de la production de cytokines, ex vivo.Ici, les cellules invalidées pour Mavs ont produit plus de cytokines antivirales que les cellules de type sauvage lors d'une infection par le gamma HV 68, ce qui reproduit le phénotype in vivo. La réexpression réconstituée de Mavs dans les MEFs invalidés pour Mavs a réduit la production de CCL5. Collectivement, ces résultats de dosage EISA et de PCR quantitative démontrent que Mavs est nécessaire pour que le gamma HV 68 supprime la production de cytokines antivirales, tant in vivo qu'ex vivo. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l'immunité innée pour explorer la réponse antivirale de l'hôte chez des souris transgéniques infectées par un herpès virus.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l'IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l'IL-1β peut être utilisé pour mesurer l'activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l'activation par l'IL-1β expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Défenses innées à des infections virales sont déclenchés par des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Les deux PRR cytoplasmiques RIG-I et PKR se lient aux ARN viraux de signature, le changement de conformation, oligomérisation, et activer la signalisation antiviral. Les méthodes sont décrites qui permettent de surveiller facilement la commutation de conformation et l'oligomérisation de ces PRR cytoplasmiques.

Suivi d&#39;activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Ce protocole décrit un test qRT-PCR à haut débit pour l’analyse des signatures d’expression d’IFN de type I et III. Le test discrimine les différences de paires de bases uniques entre les transcrits très similaires de ces gènes. Grâce à l’assemblage par lots et au pipetage robotisé, les tests sont cohérents et reproductibles.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.

Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire

Le protocole décrit une plate-forme microfluidique avancée pour mesurer quantitativement la dynamique de sécrétion de cytokines de cellules mononucléées du sang périphérique humain individuelles. La plateforme mesure jusqu’à trois cytokines en parallèle (IL-6, TNFα et IL-1β) pour chaque cellule individuelle stimulée par le lipopolysaccharide à titre d’exemple.

Approche microfluidique pour résoudre la sécrétion simultanée et séquentielle de cytokines de cellules polyfonctionnelles individuelles 

Les immunodosages à base de sang total constituent un outil facile et économe en ressources pour analyser l’immunité spécifique de l’antigène à des fins de diagnostic et de recherche. Cet article fournit un protocole optimisé à base de sang total avec double co-stimulation pour une analyse complète de l’immunité de l’hôte contre les agents pathogènes fongiques et viraux, y compris une version à faible volume pour les patients pédiatriques et les petits animaux.

Dosage du sang total avec double costimulation pour l’analyse spécifique de l’antigène de l’immunité de l’hôte contre les agents pathogènes fongiques et viraux

Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux...

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Découvrez comment le virus gamma herpès 68 détourne la protéine Mavs pour supprimer la production de cytokines antivirales chez la souris. Cette méthode révèle les mécanismes d'évasion immunitaire innée.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

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