Tranche de cerveau Biotinylation: Une Ex Vivo Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les changements aigus dans les protéines de surface neuronales. Dans les préparations de coupes de cerveau ex vivo, cela est accompli en préparant d’abord des tranches de cerveau aiguës viables. Ensuite, les tranches sont traitées avec des médicaments d’intérêt.

Ensuite, les protéines de surface cellulaire sont marquées à l’aide de réactifs de tonation impériale membranaire. Enfin, les protéines biotinylées de surface sont isolées à l’aide de la chromatographie streptococcique avide et de la chromatographie d’affinité. En fin de compte, l’immuno-plotting est utilisé pour quantifier les changements dans l’expression de surface des protéines après des traitements médicamenteux.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’administration cellulaire, est que le trafic des protéines neuronales est examiné in situ plutôt que dans des systèmes d’expression hétérologues ou des cultures neuronales primaires. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à préparer des tranches de marque viables. D’accord. Pour préparer des coupes de cerveau, commencez par faire un x liquide céphalo-rachidien artificiel ou un LCR artificiel et du saccharose complété par un LCR ou S-A-C-S-F selon le protocole de texte, refroidir.

Les S-A-C-S-F sur glace utilisent 95 % d’oxygène avec 5 % de dioxyde de carbone pour saturer les tampons d’oxygène en bouillonnant pendant 20 minutes sur la glace. Après avoir sacrifié des souris P 30 à 38 par luxation et décapitation cervicales et retiré rapidement les cerveaux, placez-les dans des S-A-C-S-F oxygénés pré-refroidis à l’aide d’un microtome vibrant. Faites des coupes cérébrales de 300 microns dans la région d’intérêt et, si vous le souhaitez, séparez les hémisphères droit et gauche pour les utiliser respectivement comme coupes de contrôle et d’expérimentation.

À l’aide d’une pipette de pâte polie au feu, transfère les tranches vers des chambres de maintien à fond grillagé contenant du LCR A oxygéné. Laissez les tranches récupérer pendant 40 minutes à 31 degrés Celsius avec un bouillonnement doux et continu. Après l’incubation, transférez les tranches dans des chambres à mailles individuelles.

Dans des assiettes à 24 puits et laver les tranches trois fois dans un LCR A oxygéné préchauffé avec des bouillonnements constants. Si vous testez des composés, ajoutez un dixième du volume d’un médicament concentré de 10 x et mélangez en inversant doucement après avoir doucement secoué les plaques dans un bain-marie à la température souhaitée. Utilisez du LCR glacé pour refroidir rapidement les tranches en les lavant trois fois pour acheter des protéines de surface.

Préparez de la biotine fraîche de 1,0 milligramme par millilitre de sulfamide N-H-S-S-S dans du LCR glacé A Ajoutez 0,75 millilitre de la solution aux tranches et incubez sur de la glace pendant 45 minutes. Après avoir utilisé de la glace Un LCR pour laver rapidement les tranches trois fois, incubez-les pendant 10 minutes dans de la glace Un LCR sur de la glace, puis utilisez un tampon de trempe de tranche glacée pour laver les tranches trois fois et incubez-les avec 0,75 millilitre de tranche, tampon de trempe deux fois pendant 25 minutes chacune sur de la glace pour tremper gratuitement la biotine suo N-H-S-S-S pour préparer des lysats tissulaires. Lavez les tranches trois fois dans un LCR A glacé avant d’utiliser une pipette à pasti polie au feu pour transférer chaque tranche dans un microtube de centrifugation.

Granulez doucement les tranches par centrifusion à 200 GS pendant une minute et aspirez soigneusement le LCR A restant. Ajoutez ensuite 400 microlitres de glaçon, déchirez un pi et utilisez une pipette P 200 pour briser le tissu en pipetant de haut en bas une fois pour terminer la lyse. Transférez le tissu dissocié dans un tube frais et incubez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec une centrifugeuse rotative à 18 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Pour granuler les débris cellulaires, isolez les protéines biotinylées et analysez-les par immuno-blot. Selon le protocole textuel, le transporteur neuronal de la dopamine est internalisé en réponse à l’activation de la PKC dans les lignées cellulaires. Malgré de nombreux rapports démontrant des pertes de dopamine, de transporteur actif ou de surface de la dette induites par la PKC dans une variété de lignées cellulaires et de systèmes d’expression, il a été difficile de confirmer cette découverte dans des neurones dopaminergiques en culture, nous avons utilisé des coupes AAL de stri de souris pour tester directement si la dat s’internalise en réponse à l’activation de la PKC dans les neurones dopaminergiques adultes, comme on l’a vu.

Ici, nous avons détecté une expression robuste de la surface DA dans le striatum de souris dans des conditions traitées au basilic ou au véhicule avec 81,4 plus ou moins 5,8 % de la dette totale à l’activation de la PKC à la surface cellulaire avec quatre balles 12. L’acétate de Myra State 13 a significativement diminué l’expression de surface à 60,8 plus ou moins 5,2 % de la dette totale, ce qui correspond à une perte d’environ 30 % de la dette de la membrane plasmique. En revanche, seulement 1,6 plus ou moins 0,4 % de la tyrosine hydroxylase totale était biotinylée, ce qui correspond à sa localisation intracellulaire et confirme que le réactif de tonation était exclu de l’intérieur cellulaire des neurones dopaminergiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les changements dans l’expression des protéines membranaires dans les terminaisons neuronales intactes.