Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

L’objectif général de cette expérience est de mesurer directement les déformations de torsion ou les changements dans la torsion des molécules d’ADN double brin au niveau de la molécule unique. Ceci est accompli à l’aide de deux tests dans le premier test appelé pince magnétique en orbite libre ou frappé. Une seule molécule d’ADN fonctionnalisée est attachée entre une perle magnétique et une surface en verre.

Alors qu’un aimant de forme cylindrique exerce une force étirant l’ADN Dans cette configuration, la position angulaire des billes n’est contrainte que par l’ADN attaché, et non par l’aimant, ce qui permet à la rotation de la perle, comme le montre la flèche rouge, de signaler les changements dans la torsion de l’ADN Les fluctuations thermiques rotationnelles de la perle sont causées. Sa position XY à poser sur un anneau circulaire ou un beignet. La conversion de cette position XY en angle de rotation permet de surveiller les changements dans la torsion de l’ADN attaché dans un deuxième test connexe appelé pince à épiler à couple magnétique, ou un aimant latéral MTTA est ajouté à l’aimant cylindrique principal pour contraindre le mouvement angulaire des billes.

Avec cette configuration d’aimant, des couples externes peuvent être appliqués à la molécule d’ADN attachée par une simple rotation de l’ensemble magnétique, des mesures de la déviation de la position angulaire des billes après l’application d’un certain nombre de tours par rapport à sa configuration initiale détendue en torsion, ainsi qu’un étalonnage de la rigidité du piège magnétique qui confine les billes, Le mouvement angulaire permet de quantifier l’accumulation de couple dans l’ADN. Le principal avantage de l’utilisation de la police et du MTT par rapport aux pinces magnétiques conventionnelles est que nous pouvons mesurer directement le couple et les changements dans la torsion des acides nucléiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la mécanique de l’ADN et de l’ARN en nous permettant de cartographier leurs réponses aux forces et aux couples externes.

Les implications de cette technique s’étendent à l’étude des interactions de l’ADN avec les protéines. Par exemple, les protéines responsables de la réparation, du stockage ou de la transcription de l’ADN La démonstration visuelle de cette méthode illustre la facilité avec laquelle une pince à épiler magnétique conventionnelle peut être modifiée pour lui donner de nouvelles capacités. La configuration utilisée pour les expériences suivantes est basée sur une pince à épiler magnétique conventionnelle.

En son centre se trouve une cellule d’écoulement éclairée par le haut par une LED et imagée par un objectif de microscope et une caméra CCD par le bas. Au-dessus de la cellule d’écoulement se trouve une tête magnétique qui peut être déplacée de haut en bas et tournée à l’aide de moteurs contrôlés par ordinateur. Les images de la caméra CCD sont analysées en temps réel par un logiciel de vue de laboratoire personnalisé pour déterminer la position X, Y et Z des billes d’ADN attachées.

Le logiciel de vue de laboratoire personnalisé est disponible sur demande auprès des auteurs. Après avoir préparé une cellule d’écoulement avec des billes magnétiques attachées à l’ADN, l’avoir montée sur la pince magnétique conventionnelle et avoir sélectionné à la fois une surface immobilisée pour la perle de référence et une perle à laquelle une molécule d’ADN individuelle de la bonne longueur est attachée. La configuration peut être convertie en mode police.

Commencez par dévisser manuellement la tête d’aimant complète qui maintient l’aimant pour la configuration conventionnelle de la pince à épiler. Remplacez-le par la tête magnétique qui maintient un aimant cylindrique pour la police. Lorsque vous placez l’aimant cylindrique utilisé pour F dans la tête de l’aimant, assurez-vous de garder la sangle d’ADN sélectionnée dans le champ de vision.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est d’aligner correctement les aimants pour la géométrie du formulaire. Un bon alignement est obtenu en déplaçant systématiquement les aimants et en testant l’alignement après chaque étape, ce que nous allons démontrer. Maintenant, effectuez un alignement de cours de l’aimant dans la police à l’aide des étapes de position pour déplacer manuellement les aimants dans le logiciel de vue de laboratoire.

Cliquez sur le bouton d’enregistrement pour mesurer les fluctuations ou les excursions de la position XY. Les traces enregistrées sont affichées à l’écran en temps réel et enregistrées sous forme de fichiers texte contenant les informations de position X, Y, Z. Si les excursions XY suivent un arc comme indiqué ici, l’aimant cylindrique n’est pas correctement aligné, continuez à déplacer l’aimant cylindrique dans la direction appropriée et à prendre des mesures jusqu’à ce que les fluctuations XY tracent un motif circulaire complet, ce qui indique que l’alignement de la trajectoire est atteint. Prochain.

Si nécessaire pour d’autres expériences, effectuez un alignement fin dans la police en utilisant une platine automatisée à haute résolution pour déplacer la cellule d’écoulement, en alignant l’aimant cylindrique à environ 10 microns de la perle. Ensuite, comme précédemment, enregistrez les excursions XY. Continuez à déplacer la platine et à enregistrer les excursions jusqu’à ce que les fluctuations sur l’anneau circulaire soient presque uniformes.

Pour vérifier l’alignement final, utilisez un script MATLAB disponible sur demande auprès des auteurs pour tracer les fluctuations d’un histogramme ou d’un thermogramme et en vérifier l’uniformité. Pour prendre des mesures du couple d’ADN, retirez l’aimant cylindrique utilisé pour la police et remplacez-le par un aimant cylindrique et un aimant latéral permanent. Pour le MTT, assurez-vous que la sangle d’ADN sélectionnée reste dans le champ de vision.

Entrez le nombre et la vitesse des tours magnétiques dans le panneau correspondant du logiciel de contrôle de la vue de laboratoire. Ici. Le nombre de tours est fixé à cinq et la cadence à 0,1 hertz. Cela entraînera une rotation lente des aimants pendant la mesure.

Ensuite, dans matlab, utilisez un script de suivi angulaire basé sur la surveillance de la position XY, qui est disponible sur demande auprès de l’auteur. Un graphique qui affiche les fluctuations angulaires en fonction du temps, thêta T apparaîtra. Une fois que tout est configuré en mode laboratoire, cliquez sur le bouton d’enregistrement.

Les traces apparaîtront en temps réel comme auparavant. Dans matlab, utilisez le script MATLAB pour produire des tracés de l’angle thêta T et de la hauteur de perle Z de T à l’écran avec un ajustement gaussien au signal d’angle afin de déterminer l’écart-type des fluctuations angulaires. Sigma thêta.

Ce script détermine directement la rigidité du piège de torsion à partir de la variance des fluctuations angulaires. Sigma thêta au carré en radians. En utilisant la formule présentée ici, notez qu’il est typique dans le MTT d’atteindre une rigidité de piège en rotation de 10 à 1000 pico newton nanomètre par radian, ce qui est beaucoup plus faible que dans les pinces magnétiques conventionnelles.

Ici, par exemple, nous avons déterminé que la rigidité du piège de rotation était d’environ 52 nanomètres de porc par radian. La rigidité du piège de rotation de la pince à épiler à couple magnétique par rapport aux pinces à épiler magnétiques conventionnelles la rend adaptée aux mesures de couple à molécule unique, mais signifie également que le couple maximal pouvant être exercé est réduit. Cela implique que le MTT ne peut pas contrebalancer les couples de traînée causés par une rotation rapide.

Il faut donc veiller à ne pas tourner trop vite. Nous tournons généralement à des fréquences d’environ 0,1 hertz. Ensuite, l’attache d’ADN est submergée par la rotation lente des aimants, un nombre défini de tours, et en enregistrant une autre trace de fluctuations angulaires, le nombre et le taux de tours de l’aimant sont à nouveau saisis dans le panneau correspondant du logiciel de contrôle de la vue de laboratoire.

Ici, le nombre de tours est fixé à 40 et le débit est fixé à 0,1 hertz. Cela entraînera une rotation lente des aimants pendant la mesure pour déterminer le couple accumulé dans le câble d’acide nucléique. Après N tours, nous utilisons la formule présentée ici où les crochets angulaires désignent la moyenne et thêta zéro.

Et thêta N sont l’angle à zéro tour correspondant respectivement à une attache et des tours détendus en torsion. Répétez les étapes de rotation des aimants et enregistrez un plateau de fluctuations angulaires si nécessaire afin de déterminer pleinement la réponse toque d’une molécule en une seule mesure. Pour mesurer les changements dans la torsion de l’ADN induits par la protéine de réparation RAD 51 dont la liaison à l’ADN double brin, à la fois allonge et déroule.

L’ADN rad 51 a été ajouté à une molécule d’ADN attachée à la police. Comme on le voit ici, la perle trace une trajectoire en spirale. Ce mouvement peut être découplé en composants qui décrivent comment l’ADN s’allonge et se déroule au fil du temps.

Pour mesurer le couple stocké dans l’ADN à l’aide du MTT, la molécule avec systématiquement sur-enroulement et sous-bobinage et les fluctuations angulaires ont été mesurées pour chaque nombre de tours appliqués. L’écart-type des fluctuations angulaires, qui rend compte de la rigidité du piège angulaire, doit être indépendant du nombre de tours appliqués. Ici, l’écart-type est d’environ neuf degrés, comme indiqué ici.

La moyenne des positions angulaires change systématiquement avec le nombre de tours appliqués en utilisant la rigidité constante du piège angulaire. Les changements de l’angle moyen sont convertis en couple, ce qui donne le couple stocké dans l’ADN par rapport aux tours appliqués. L’enregistrement simultané de la position Z des billes permet d’obtenir la longueur de l’ADN par rapport aux tours appliqués.

Ensemble, ces deux courbes produisent la réponse mécanique complète de l’ADN au surenroulement et au sous-enroulement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer, de tordre et de coupler des molécules biologiques à l’aide de la pince à épiler magnétique en orbite libre et de la pince à couple magnétique pour obtenir de nouveaux dosages de molécules uniques auxquels les pinces magnétiques conventionnelles peuvent facilement être adaptées. Le développement de ces techniques ouvre la voie à la recherche dans le domaine de la biophysique, par exemple, pour étudier les propriétés de torsion de l’ADN ou de l’ARN et pour observer des processus tels que la compaction et la réparation de l’ADN. Les techniques de police et de MTT peuvent être améliorées par d’autres méthodes telles que la détection par fluorescence afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la détermination de l’emplacement particulier d’une protéine sur un ADN attaché.