JoVE Science Education

Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Électroporation des embryons de poulet in ovo

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

In ovo Electroporation of Chicken Embryos

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

24,769 Views

•

06:57 min

•

April 30, 2023

Overview

L’électroporation est une technique utilisée dans la recherche biomédicale qui permet la manipulation de l’expression de gènes par l’intermédiaire de la livraison de matériel génétique étranger dans les cellules. Plus précisément, l’électroporation in ovo est effectuée sur des embryons (Gallus gallus domesticus) dans leurs coquilles à des stades précoces du développement. Lors de cette procédure, de l’ADN ou des fragments nucléotidiques pour l’inactivation génétique sont d’abord injectés dans un tissu cible. Toutefois, le matériel génétique est incapable de pénétrer la membrane plasmique pour effectuer sa fonction à l’intérieur de la cellule. Pour résoudre ce problème, un champ électrique est appliqué, ce qui provoque des perturbations temporaires, altère la stabilité et crée des pores à travers la membrane plasmique. Ce champ électrique permet également d’attirer les acides nucléiques chargés négativement à migrer vers l’électrode positive, donc de conduire de manière efficace l’ADN ou les fragments nucléotidiques pour l’inactivation génétique dans la cellule. L’avantage majeur de cette technique est l’administration de matériel génétique de façon localisée à des groupes de cellules, à des moments spécifiques du développement. Par conséquent, les mécanismes génétiques qui régissent les évènements du développement peuvent être examinés.

Cette vidéo donne un aperçu des principes sous-jacents à l’électroporation in ovo et présente les outils nécessaires pour exécuter cette technique, y compris la fabrication d’aiguilles pour micropipettes, le placement des électrodes et l’exécution de l’électroporation. Le protocole présente les étapes nécessaires pour l’exécution de cette procédure avant d’introduire quelques exemples fascinants qui démontrent comment cette technique est utilisée pour effectuer une variété de manipulations génétiques sur des embryons de poulet.

Procedure

L’électroporation est une technique utilisée pour introduire un matériel génétique exogène dans des cellules. L’électroporation d’embryons de poulet réalisée à l’intérieur de l’œuf, ou in ovo, est un outil précieux pour les biologistes du développement, car la livraison de matériel génétique peut être localisée dans des tissus spécifiques et à des moments spécifiques du développement. Cette vidéo présente les principes de base d’électroporation in ovo, décrit les étapes essentielles de la procédure, et discute de la façon dont cette technique peut être utilisée pour étudier les processus biologiques au cours du développement.

Pour commencer, passons en revue les principes de base de l’électroporation pour comprendre comment elle peut être utilisée pour transférer de l’ADN dans une cellule.

Tout d’abord, la micro-injection est utilisée pour délivrer l’ADN en étroite proximité avec une cellule d’intérêt. Cependant, l’ADN ne peut pas pénétrer la membrane plasmique et entrer dans la cellule.

Pour résoudre ce problème, un courant électrique est appliqué pour perturber la stabilité de la membrane, créant des pores. Une seconde conséquence de ce champ électrique, est la migration de l’ADN chargé négativement vers l’électrode positive. Par conséquent, seules les cellules les plus proches de l’électrode positive deviennent transfectées avec l’ADN.

Maintenant que vous connaissez les principes de base, parlons de la préparation des embryons pour l’électroporation. Si vous avez besoin d’utiliser des embryons âgés au-delà du stade 20 selon Hamburger Hamilton, il est préférable de cultiver vos embryons à l’extérieur de la coque, ou ex ovo, pour avoir un accès plus facile aux tissus. Cette vidéo se concentre sur l’électroporation effectuée dans la coquille, ou in ovo, sur des embryons aux stades précoces de développement.

Pour commencer, les œufs doivent être incubés dans un incubateur humidifié à 37 °C, jusqu’à ce qu’ils aient atteint le stade de développement souhaité. Pendant que les œufs incubent, préparer les outils pour l’injection et l’électroporation. Premièrement, fabriquez des-micropipettes en étirant une pipette en verre de 0,5 mm avec une étireuse. Pour ouvrir le bout de la micropipette, placez la micropipette sous un microscope et cassez un petit morceau de la pointe. Ensuite, préparez la solution d’injection, qui devrait contenir une dilution appropriée de l’ADN à l’étude, ainsi qu’un colorant pour vous aider à visualiser la solution injectée.

Attachez l’aiguille à un tuyau souple pour contrôler le mouvement du fluide avec la bouche. L’aiguille peut aussi être connectée à un micro-injecteur, qui produit des changements de pressions d’air réglables. Remplissez la micropipette en immergeant la pointe dans la solution d’injection et appliquez une pression négative.

En plus des aiguilles, vous aurez également besoin d’électrodes. Celles-ci consistent en deux fils dénudés maintenus ensembles par un adaptateur. Une paire de câbles connecte les électrodes au générateur électrique d’impulsions, ou électroporateur, qui contrôle la durée d’impulsion, la fréquence et la tension électrique. Pour un fonctionnement mains libres, l’électroporateur peut être activé par une pédale.

Une fois que les œufs sont prêts, découpez une fenêtre dans la coquille, et ajoutez quelques gouttes de solution saline physiologique, comme celle de Hanks, pour empêcher l’embryon de se dessécher. Au microscope, positionnez l’œuf de telle sorte que le tissu d’intérêt soit accessible à l’aiguille. Ensuite, percez l’embryon avec l’aiguille et délivrez la solution en appliquant une légère pression.

Maintenant que nous avons injecté l’ADN, il est temps d’accomplir l’électroporation. Placez les électrodes de sorte qu’elles soient immergées dans la solution de Hank et que le tissu d’intérêt soit centré entre les deux électrodes. Afin d’appliquer le courant électrique, appuyez sur la pédale et observez les bulles se formant autour des électrodes.

Une fois l’électroporation terminée, retirez les électrodes et essuyez les avec une solution d’éthanol à 70%. Ajoutez quelques gouttes de solution saline avec un supplément d’antibiotiques pour prévenir l’infection, et refermez la fenêtre avec du ruban adhésif. Enfin, replacez les œufs dans l’incubateur pour continuer leur développement avant d’analyser leur phénotype.

Maintenant que nous savons tout au sujet de l’électroporation in ovo, regardons quelques exemples d’application de cette technique par les scientifiques, dans la recherche développementale.

Pour commencer, l’électroporation peut être utilisée pour bloquer l’expression de gènes par la livraison de séquences nucléotidiques pour l’inactivation génétique. Dans cet exemple, les cellules du tube neural en développement ont été soumises à une électroporation avec un fragment d’acide nucléique pour l’inactivation génétique. Les embryons se sont développés, puis les trajectoires axonales furent comparées entre les échantillons normaux et ceux après l’inactivation génétique pour évaluer le contrôle génétique sur le guidage axonal.

A l’inverse, l’électroporation in ovo peut également être utilisée pour exprimer une protéine dans un sous-groupe de cellules, par l’introduction d’un plasmide contenant un gène codant les protéines, et un promoteur : une séquence qui lie l’ARN polymérase pour initialiser la transcription. Ici, les chercheurs ont livré un gène seul dans les cellules du cerveau au stade embryonnaire. Le marquage des tissus pour détecter à la fois la protéine produite par ce gène ainsi que les marqueurs de sous-types de neurones spécifiques, montre que le gène électroporé altère le développement neural.

Les fragments d’ADN codant pour des protéines fluorescentes peuvent également être introduits par électroporation afin de visualiser certaines cellules et structures au cours du développement. Cela permet la visualisation en direct de processus complexes, tels que le développement de la moelle épinière, ce qui donne un aperçu de la dynamique des mouvements cellulaires dans le temps.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’électroporation in ovo, une technique utile pour administrer du matériel génétique dans les embryons de poulet. Cette vidéo a présenté les principes de base de l’électroporation, les étapes nécessaires afin d’injecter et de réaliser l’électroporation, ainsi que des utilisations de cette technique dans la recherche du développement. Merci de nous avoir regardés!

Transcript

Electroporation is a technique used to introduce foreign genetic material into cells. Electroporation of chick embryos inside the egg, or in ovo electroporation, is a valuable tool for developmental biologists because the delivery of genetic material can be localized to specific tissues and specific developmental time points. This video will introduce the basic principles of in ovo electroporation, describe essential steps of the procedure, and discuss how this technique can be used to study biological processes during development.

To start, let’s review the basic principles of electroporation to figure out how it can be used to get DNA into a cell.

First, microinjection is used to deliver the DNA in close proximity to a cell of interest. However, the DNA can’t penetrate the plasma membrane to get into the cell.

To solve this problem, an electrical current is applied to disrupt the stability of the membrane, creating pores. A second consequence of this electric field is the migration of the negatively charged DNA towards the positive electrode. As a result, only cells on the side of the injection site closer to the positive electrode become transfected with the DNA.

Now that you know the basic principles, let’s talk about how to prepare embryos for electroporation. If you need to use embryos older than Hamburger Hamilton stage 20, it’s best to culture your chicks outside of the shell, or ex ovo, for improved tissue access. This video will focus on electroporations performed on early embryos developing within the shell, or in ovo.

To begin, eggs should be incubated in a humidified incubator at 37 °C until they have reached the desired developmental stage. While the eggs are incubating, prepare the tools for injection and electroporation. First, make capillary needles by pulling a 0.5 mm glass pipet with a pipet puller. To open the pipet, place it under a microscope and break off a small piece of the tip. Then, prepare the injection solution, which should contain an appropriate dilution of your construct as well as a dye to help you visualize the injected solution.

To control the movement of fluid within the needle, attach it to a human-powered mouth pipet. Alternatively, the needle can be loaded onto a microinjector, which provides adjustable pressure pulses of air. Fill the needle by submerging the tip in the injection solution and applying negative pressure.

In addition to needles, you’ll also need electrodes. These consist of two exposed wires fixed together by an adaptor. A pair of cables connects the electrodes to the electric pulse generator, or electroporator, which controls the pulse duration, frequency, and voltage. For hands free operation, the electroporator can be activated by a foot pedal.

Once the eggs are ready, cut a window in the shell, and add a few drops of physiological salt solution, such as Hanks, to prevent the embryo from drying out. Under a microscope, position the egg such that the tissue of interest is accessible to the needle. Then, pierce the embryo with the capillary needle and deliver the solution by applying gentle pressure.

Now that we’ve injected the construct, it’s time to perform the electroporation. Position the electrodes so that they are submerged in the Hank’s solution and the tissue of interest is centered between them. In order to apply the electrical current, press the foot pedal and look for bubbles forming around the electrodes.

Once the electroporation is complete, remove the electrodes from the embryo and wipe them down with 70% ethanol. Add a few drops of salt solution supplemented with antibiotics to prevent infection, and seal the window with tape. Finally, place the eggs back in the incubator for continued development prior to phenotypic analysis.

Now that we’ve learned all about in ovo electroporation, let’s look at some examples of how scientists are applying this technique in developmental research.

To begin, electroporation can be used to block gene expression by delivery of knockdown constructs. In this example, cells of the developing neural tube were electroporated with gene silencing constructs. The embryos were allowed to develop, and then axon trajectories were compared between normal and knockdown samples to assess the genetic control of axon guidance.

On the flipside, in ovo electroporation can also be used to express a protein in a subset of cells by introducing a plasmid containing a protein-encoding gene and a promoter: a sequence which binds RNA polymerase to initiate transcription. Here, scientists delivered a single gene into cells of the embryonic brain. Tissue staining to detect both the protein product of this gene and markers of specific neural subtypes shows that the electroporated gene alters neural development.

DNA constructs encoding fluorescent proteins can also be introduced by electroporation to visualize cells and structures during development. This allows for live imaging of complex processes, such as spinal cord development, giving insight into the dynamics of cell movements over time.

You’ve just watched JoVE’s introduction to in ovo electroporation, a useful technique for delivering genetic material into chicks. This video discussed the basic principles of electroporation, steps required to inject and electroporate chicks, and applications of this technique in current developmental research. Thanks for watching!

Tags

Electroporation In Ovo Electroporation Genetic Material Cells Chick Embryos Developmental Biologists Developmental Time Points DNA Delivery Microinjection Plasma Membrane Electrical Current Pores Positive Electrode Transfected Cells Hamburger Hamilton Stage 20 Ex Ovo Culture