Culture des embryons de poulet ex ovo

Le poussin est un organisme modèle polyvalent adapte a l’étude des etapes du développement car la plupart de son développement a lieu en dehors de la mère. Néanmoins, la coquille de l’œuf empêche l’accès à l’embryon pour certaines formes d’expérimentation. Heureusement, les poussins peuvent être incubés en dehors de la coquille, ou « ex ovo », en utilisant des ustensiles communément disponibles au labo. Dans cette vidéo, vous apprendrez les principes de la culture ex ovo, les procédures pas à pas pour deux méthodes de culture différentes et les utilisations de la technique dans des études du développement.

Avant de parler de la manière d’élever des poussins ex ovo, passons en revue les principes de la technique. A l’intérieur de l’œuf, le poussin se développe en association proche avec la membrane vitelline entourant le jaune. Le volume restant est rempli d’albumine, ou blanc d’œuf, qui protège l’embryon et sert de source de protéine. La culture hors coquille peut être réalisée via la culture du jaune entier, en utilisant tout le contenu de l’œuf dans un simple récipient. D’autre part, les tissus embryonnaires peuvent être excisés et cultivés dans une culture d’explant. Ces deux techniques ont des avantages notables par rapport à l’utilisation de fenêtres dans les œufs.

Tout d’abord, le fenêtrage d’embryons de poulet aux stades tardifs est compliqué, à cause de la présence de nombreux vaisseaux sanguins essentiels qui se développent à l’intérieur des membranes qui entourent le poulet. Cela rend la méthode ex ovo préférable pour le travail avec des poussins aux stades ultérieurs.

Deuxièmement, les installations de la culture ex ovo sont plus disposées à l’imagerie de haute résolution car elles sont plus faciles à installer dans les instruments d’imagerie. De plus, retirer les embryons de leurs coquilles permet d’exposer un plus grand nombre de tissus pour les manipulations expérimentales comme la microchirurgie et la microinjection.

Vu que le poulet compte sur la coquille pour sa protection et les minéraux essentiels, l’embryon survivant sans cette structure demande une attention supplémentaire. Par exemple, le logement doit être conceptualisé pour maintenir un environnement stérile et humide, et les nutriments doivent être fournis sous forme d’albumine ou de milieu de culture. Pour une culture à long-terme, de la coquille écrasée est aussi requise comme source de calcium. En outre, vu que les tensions sur les membranes englobant l’embryon sont importantes pour un développement normal, une culture ex ovo réussie dépend aussi de la capacité du logement à maintenir la morphologie membranaire.

Maintenant que vous connaissez les bases, il est temps de sortir le poussin ! Pour préparer les œufs à une culture ex ovo du jaune entier, commencez par les incuber à 37,5 °C le temps d’atteindre le stade désiré.

Pendant que vous attendez, préparez le logement. Des plaques de Pétri, des coupelles de pesée et des hamacs sont couramment utilisés pour accueillir le contenu des œufs. D’abord, stérilisez tous les éléments par traitement UV ou à l’éthanol. Ensuite, préparez une chambre extérieure remplie avec de l’eau stérile pour maintenir l’humidité pendant l’incubation.

Lorsque les œufs sont prêts, placez les en position horizontale pour quelques minutes afin que l’embryon monte au sommet. Craquez alors le bas de la coquille et transférez précautionneusement le contenu de l’œuf dans son nouveau logement. Enfin, couvrez le réceptacle afin de maintenir l’humidité, et placez l’installation dans un incubateur jusqu’à l’âge désiré pour des procédés en aval.

Une stratégie alternative d’ex ovo, la culture d’explant, requiert quelques étapes additionnelles après l’enlèvement de l’embryon de sa coquille.

Dans cette technique, la membrane vitelline est doucement séparée du jaune, emportant l’embryon en développement avec elle.

Ensuite, la membrane est montée en vue de maintenir la tension, ce qui peut être fait en tendant le tissu autour d’un anneau de verre ou par simple adhérence à du papier filtre. Après le montage, du milieu de culture est ajouté pour couvrir le tissu, et l’embryon est placé dans une chambre humidifiée.

L’embryon explanté peut maintenant être remis dans un incubateur pour une duree allant jusqu’à 24 heures de développement supplémentaire.

Après avoir appris les principes et méthodes de la culture ex ovo, nous sommes prêts pour quelques jeux de volaille.

La culture ex ovo est particulièrement utile lorsque vous avez besoin d’altérer l’expression d’un gène dans des embryons plus âgés. Une des approches est l’électroporation, lors de laquelle un courant électrique est utilisé pour perméabiliser les membranes cellulaires pour la livraison de matériel génétique. Vu que les embryons cultivés ex ovo sont hautement accessible pour l’imagerie, l’assimilation du matériel génétique peut facilement être validée par imagerie de fluorescence des embryons entiers.

L’imagerie en temps réel de la dynamique des cellules est aussi possible en utilisant la culture ex ovo. Les cellules de cancer humain peuvent former des tumeurs en récupérant les vaisseaux sanguins de la membrane chorioallantoique du poussin, ou CAM. Après la formation de tumeur, les particules fluorescentes peuvent être injectées directement dans le flux sanguin et tracées en temps réel. L’accumulation de particules dans les tissus tumoraux peut être utilisée comme indicateur d’angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Même si les embryons entiers peuvent être cultivés en utilisant les techniques d’explant, quelques expériences requièrent que les tissus embryonnaires soient disséqués avant la culture. Par exemple, des tissus neuronaux en développement peuvent être excisés et cultivés sur des lamelles en verre. Après une période d’incubation, une population spécifique de cellules connue comme la crête neuronale peut être observée fuyant les tissus. Le traitement avec des agents expérimentaux et l’imagerie à laps de temps peuvent alors être utilisés pour tester les facteurs contrôlant la migration des cellules.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur la culture de poussins ex ovo. Cette vidéo a couvert les principes de la culture ex ovo, les bases des méthodes du jaune entier et d’explant et quelques façons dont ces techniques sont utilisées au labo aujourd’hui. Merci de nous avoir regardés !