4.14: Culture des embryons de poulet ex ovo

Le poussin est un organisme modèle polyvalent pour l’étude des voies de développement, car la majeure partie de son développement a lieu en dehors de la mère. Néanmoins, la coquille de l’œuf empêche l’accès à l’embryon pour certaines formes d’expérimentation. Heureusement, les poussins peuvent être incubés à l’extérieur de la coquille, ou « ex ovo, ? en utilisant certaines fournitures de laboratoire couramment disponibles. Dans cette vidéo, vous découvrirez les principes de la culture ex ovo, les procédures étape par étape pour deux méthodes de culture différentes et les applications de la technique dans les études de développement.

Avant de parler de la façon d’élever des poussins ex ovo, passons en revue quelques principes de la technique. À l’intérieur de l’œuf, le poussin se développe en étroite association avec la membrane vitelline qui entoure le jaune. Le volume restant est rempli d’albumine, ou blanc d’œuf, qui protège l’embryon et sert de source de protéines.

La culture à l’extérieur de la coquille peut être effectuée via une culture de jaunes entiers, en utilisant tout le contenu de l’œuf dans un simple récipient. Alternativement, les tissus embryonnaires peuvent être excisés et cultivés en culture ex ovo explant. Ces deux techniques présentent des avantages distincts par rapport à l’utilisation d’œufs fenêtrés.

Tout d’abord, le fenêtrage des embryons de poulet à un stade ultérieur est compliqué en raison de la présence de nombreux vaisseaux sanguins cruciaux, qui se développent dans les membranes qui entourent le poussin. Cela rend la méthode ex ovo préférable pour travailler avec les poussins à des stades ultérieurs.

Deuxièmement, parce qu’elles peuvent s’intégrer dans des plates-formes d’imagerie, les configurations de culture ex ovo se prêtent mieux à l’imagerie à haute résolution.

De plus, le retrait d’embryons de la coquille expose un plus grand nombre de tissus à des manipulations expérimentales telles que la microchirurgie et la microinjection.

Étant donné que le poussin dépend de la coquille de l’œuf pour se protéger et obtenir des minéraux essentiels, la survie de l’embryon sans cette structure nécessite des soins supplémentaires. Par exemple, le logement doit être conçu pour maintenir un environnement stérile et humide, et les nutriments doivent être fournis sous forme d’albumine ou de milieu de culture. Pour la culture à long terme, la coquille broyée est également nécessaire comme source de calcium. De plus, étant donné que la tension sur les membranes supportant l’embryon est importante pour le développement normal, le succès de la culture ex ovo dépend en outre d’un logement qui maintient une morphologie membranaire normale.

Maintenant que vous connaissez les bases, il est temps de vous dégonfler ! Pour préparer des œufs pour la culture ex ovo de jaunes entiers, commencez par les incuber à 37,5 ? C jusqu’à juste avant l’étape souhaitée.

Pendant que vous attendez, préparez le logement. Les boîtes de Pétri, les bateaux de pesée et les hamacs sont couramment utilisés pour contenir le contenu des œufs. Tout d’abord, stérilisez tous les composants par traitement à la lumière UV ou à l’éthanol.

De plus, préparez une chambre extérieure remplie d’eau stérile pour maintenir l’humidité pendant l’incubation.

Lorsque les ovules sont prêts, placez-les en position horizontale pendant quelques minutes pour que l’embryon remonte vers le haut. Ensuite, cassez le bas de la coquille et transférez soigneusement le contenu de l’œuf dans le boîtier. Enfin, couvrez le récipient du boîtier pour maintenir l’humidité et placez l’installation dans un incubateur jusqu’à ce que l’âge souhaité soit atteint pour le traitement en aval.

Une stratégie alternative ex ovo, la culture par explantation, nécessite quelques étapes supplémentaires après le retrait de l’embryon de la coquille.

Dans cette technique, la membrane vitelline est doucement séparée du jaune, emportant avec elle l’embryon en développement.

Ensuite, la membrane est montée afin de maintenir la tension, ce qui peut être fait en resserrant le tissu autour d’un anneau de verre ou par simple adhérence sur du papier filtre.

Après le montage, un milieu de culture est ajouté pour couvrir le tissu et l’embryon est placé dans une chambre humidifiée.

Les embryons explantés peuvent maintenant être renvoyés dans un incubateur jusqu’à 24 heures de développement ultérieur.

Après avoir appris les principes et les méthodes de la culture ex ovo, nous sommes prêts pour un peu de jeu avec les volailles.

La culture ex ovo est particulièrement utile lorsque vous devez modifier l’expression des gènes chez des embryons plus âgés. L’une des approches est l’électroporation, dans laquelle un courant électrique est utilisé pour perméabiliser les membranes cellulaires afin de libérer du matériel génétique. Étant donné que les embryons cultivés ex ovo sont également très accessibles pour l’imagerie, l’absorption du matériel génétique peut facilement être validée par imagerie fluorescente d’embryons entiers.

L’imagerie en temps réel de la dynamique cellulaire est également possible grâce à la culture ex ovo. Les cellules cancéreuses humaines peuvent former des tumeurs en cooptant les vaisseaux sanguins de la membrane chorioallantoïdienne du poulet, ou CAM. Après la formation de la tumeur, des particules fluorescentes peuvent être injectées directement dans la circulation sanguine et suivies en temps réel. L’accumulation de particules dans le tissu tumoral peut être utilisée comme indicateur de l’angiogenèse ou de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Bien que des embryons entiers puissent être cultivés à l’aide de techniques d’explantation, certaines expériences exigent que les tissus embryonnaires soient disséqués avant la culture. Par exemple, le tissu neural en développement peut être excisé et cultivé sur des lamelles de verre. Après une période d’incubation, on peut observer une population spécifique de cellules connue sous le nom de crête neurale s’éloigner du tissu. Le traitement avec des agents expérimentaux et l’imagerie timelapse peuvent ensuite être utilisés pour tester les facteurs contrôlant la migration cellulaire.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur la culture du poussin ex ovo. Cette vidéo aborde les principes de la culture ex ovo, les bases des méthodes de l’ex-vitellus entier et de l’explant, ainsi que certaines des façons dont ces techniques sont utilisées dans les laboratoires aujourd’hui. Merci d’avoir regardé !