Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l'imagerie et le traitement pharmacologique

L’objectif global de cette procédure est de préparer des cultures ex vivo de drosophile, de testicules pupillaires et de kystes germinaux pour effectuer des études d’imagerie en direct et des traitements inhibiteurs pour analyser post-miotique. Pour la myogenèse, cela est accompli en disséquant d’abord les testicules intacts du puy précoce 24 heures après la formation du purium. La deuxième étape consiste à disséquer des kystes germinaux uniques de ces testicules, puis des testicules intacts et des kystes germinaux uniques peuvent être utilisés pour des expériences d’imagerie en direct. Alternativement, l’étape suivante consiste à incuber les testicules intacts ou le kyste germinal avec des composés inhibiteurs.

En fin de compte, l’immunocoloration des courges, des testicules et la microscopie à fluorescence sont utilisées pour surveiller l’effet du traitement. Le principal avantage de cette technique de culture ex vivo par rapport aux méthodes génétiques existantes est qu’elle permet d’accéder à la spermatogenèse dilo pendant les stades post-miotiques. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode ont du mal parce que certaines expériences nécessitaient de disséquer et de manipuler les tissus pupillaires.

Pour commencer l’expérience, distribuez des gouttes de 80 microlitres de boucliers et de milieu d’insecte San M three avec du sérum fœtal bovin et des antibiotiques dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Ensuite, à l’aide d’une large paire de pinces, prélevez une chrysalide et transférez-la dans une goutte de milieu sur le plat. Transférez ensuite les matériaux dans un stéréomicroscope équipé d’un illuminateur à fibre optique.

Veillez à ne pas chauffer les testicules au-dessus de la température ambiante pendant la dissection à l’aide de la pince numéro cinq. Saisissez la chrysalide par son extrémité la plus postérieure et maintenez-la en position. Saisissez les sphères antérieures avec une autre paire de pinces et ouvrez la pupille par une permanente à son extrémité antérieure.

Décollez la pupille jusqu’à ce qu’au moins une partie du thorax soit exposée. Continuez à maintenir la nymphe en position par son extrémité la plus postérieure et relâchez la pression interne de la chrysalide en insérant les deux bras d’une paire de pinces dans la région de la tête de la nymphe. Ensuite, ouvrez la chrysalide en ouvrant la pince et en déplaçant la pince dans la direction antérieure et assurez-vous que l’ouverture est aussi grande que possible lors de la première tentative.

Évitez d’endommager la chrysalide à son extrémité postérieure avant que la pression ne soit relâchée. Cela pourrait entraîner la poussée directe des testicules à travers la petite ouverture et les endommager. Une fois la chrysalide ouverte, la pression interne relâchée de la chrysalide expulse le glomérat de cellules et de tissus adipeux à travers la grande ouverture.

Augmentez ensuite la taille de l’ouverture à l’aide d’une paire de pinces et évitez de presser la chrysalide avec la pince car cela pourrait endommager les testicules. Ensuite, tenez la chrysalide à son extrémité la plus postérieure près de vous. L’autre paire de pinces et strient doucement le contenu de la nymphe de l’arrière vers l’avant pour libérer les testicules de la nymphe.

Vérifiez si les testicules de la pupille ont été poussés vers l’extérieur. Ils ne seront connectés à aucun autre tissu. À 24 heures, un PF prélève les testicules avec une pointe de pipette prédécoupée de 200 microlitres.

Transférez seulement une petite quantité du milieu pour réduire le nombre de cellules graisseuses du corps transportées avec les testicules. Placez ensuite les testicules dans un milieu dans un plat de culture frais. Lavez les testicules plusieurs fois avec un moyen jusqu’à ce qu’il ne reste que quelques cellules graisseuses pour l’imagerie en direct.

Transférez les testicules dans une boîte de culture à fond de verre avec un milieu et utilisez un microscope à imagerie inversée pour commencer la dissection. Transférez un ou plusieurs testicules pupillaires dans une boîte de culture à fond de verre remplie de milieu. Utilisez un stéréomicroscope avec éclairage à fibre optique et deux aiguilles en acier inoxydable pour la dissection des kystes germinaux masculins.

Avec une aiguille soigneusement épinglée, un testicule à son extrémité antérieure ou postérieure et maintenez-le en position. Insérez l’autre aiguille dans le testicule et perturbez la gaine du testicule en déplaçant l’aiguille sur le côté, ce qui libérera de nombreux kystes. Continuez à maintenir un testicule en position avec une aiguille.

Utilisez ensuite l’autre aiguille pour faire sortir doucement les kystes restants du testicule. Ensuite, séparez les kystes agrégés. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres en transférant les kystes dans une boîte de culture fraîche avec du milieu.

Déplacez ensuite la boîte de culture vers un microscope à imagerie inversée pour l’imagerie en direct de kystes uniques. Dispersez à nouveau les kystes avec une aiguille si nécessaire, identifiez le stade des kystes à l’aide de la microscopie à contraste de phase et à fluorescence. Concentrez-vous sur un kyste du stade souhaité.

Confirmez fréquemment la mise au point et la position du kyste. Lors d’expériences d’imagerie plus longues, les kystes n’adhèrent pas au fond de la boîte de culture. Intention de flotter hors de la mise au point.

Remplissez chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec 500 microlitres de milieu pour une expérience de 12 répétitions. Transférez ensuite un testicule pupillaire dans chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette prédécoupée de 200 microlitres. Ensuite, vérifiez la présence de protamine dans les testicules isolés à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

Les testicules doivent être exempts de protamine, signal B-E-G-F-P, ce qui indique que le changement hisone-protamine ou HP n’a eu lieu dans aucun des kystes. Remplacez les testicules qui présentent déjà des kystes positifs. Ajoutez 500 microlitres de milieu contenant de l’acide endocarique, le composé inhibiteur pour atteindre une concentration finale de 150 micromolaires dans un millilitre dans chacun des 12 premiers puits.

Utilisez les puits restants comme témoins non traités en ajoutant 500 microlitres de milieu avec solvant. Ensuite, incubez la plaque à cinq degrés Celsius pendant 24 heures dans l’obscurité. Vérifiez à nouveau la présence de protamine dans les testicules incubés.

Les testicules de contrôle devraient maintenant montrer un ou plusieurs kystes positifs à la protamine, B-E-G-F-P, ce qui indique une transition à travers le commutateur HP. Ensuite, à l’aide d’une pipette avec un embout de 200 microlitres, transférez les testicules sur des lames recouvertes de lysine poly L. Effectuez des préparations de courge et colorez-les avec des anticorps fluorescents.

Selon les protocoles publiés, des images en contraste de phase des testicules de la drosophile ont été obtenues à l’aide de cette méthode de dissection. Il s’agit d’un monticule entier légèrement écrasé d’une chrysalide de drosophile. 24 heures après la formation d’un PY ou d’une PF, les spermatogonies sont limitées à l’extrémité antérieure sous la région centrale.

Le testicule restant est rempli de spermatocytes, de spermatides au stade actuel de Nevin avec des noyaux ronds et de spermatides aux stades allongés avec des superpositions de flagelles en croissance de contraste de phase, des images fluorescentes EGFP et RFP à partir de testicules pupillaires montés à domicile ont été obtenues pour détecter H, deux, A-V-D-R-F-P et la protamine B-E-G-F-P à 24 heures A, PF. Aucune des spermatides n’a subi le changement HP fréquemment. Les testicules disséqués à ce stade contiennent une structure d’autofluorescence. Un testicule pupillaire disséqué 36 heures Un PF présente le premier kyste positif à la protamine, B-E-G-F-P.

Les testicules pupillaires de 48 heures A PF ont plusieurs kystes germinaux avec des noyaux positifs à la protamine visibles. Des images en direct ex vivo en accéléré de testicules entiers se développant en culture peuvent être enregistrées. En utilisant cette méthode, un testicule pupillaire a été disséqué pendant 45 heures, un PF incubé dans un milieu pendant six heures et imagé toutes les cinq minutes.

Au cours de cette période, plusieurs kystes de spermatides émergent de l’étage de commutation HP et montrent un signal de protamine brillant B-E-G-F-P. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir un testicule pupillaire précoce et un kyste germinal unique en culture afin d’effectuer des traitements d’imagerie in vivo ou des traitements inhibiteurs.