Mesurer les flux d'éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

In planta, la mesure des flux de nutriments et de toxiques est essentielle à l’étude de la nutrition et de la toxicité des plantes. Ici, nous couvrons les protocoles de radiotraceurs pour la détermination de l’afflux et de l’efflux dans les racines intactes des plantes, en utilisant les flux de potassium (K⁺) et d’ammoniac/ammonium (NH₃/NH₄⁺) comme exemples. Les avantages et les limites de ces techniques sont discutés.

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer les flux unidirectionnels de potassium et d’ammoniac à l’intérieur et à l’extérieur des racines de semis d’orge intacts, et de caractériser le fonctionnement des principaux systèmes de transport des nutriments dans les membranes végétales. Ceci est réalisé en cultivant d’abord des semis pendant une semaine dans des solutions hydroponiques de composition chimique spécifique pour s’assurer que les plantes sont dans un état stable nutritionnel. La culture hydroponique permet aux racines d’être accessibles pour des manipulations expérimentales.

Dans un deuxième temps, les racines de plantes intactes sont immergées pendant des périodes variables dans des solutions expérimentales, y compris des solutions d’absorption, dont le substrat d’intérêt est enrichi de son isotope radioactif. Cette étape servira à déterminer les taux de transport à l’intérieur et à l’extérieur des semis. Ensuite, les plantes sont soit disséquées immédiatement après une courte période d’absorption pour les expériences d’afflux unidirectionnel, soit transférées dans un entonnoir FLX après une absorption plus longue pour la mesure de la libération de traceur.

En utilisant l’analyse compartimentale par traceur, flx ou Kate, on obtient des résultats qui peuvent révéler des aspects clés de la capacité, de l’énergie, des mécanismes et de la régulation des systèmes de transport. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la physiologie nutritionnelle des plantes, telles que comment les nutriments minéraux et les toxiques sont-ils transportés à l’intérieur et à l’extérieur des plantes ? Comment ces flux réagissent-ils aux environnements changeants et comment affectent-ils la compartimentation cellulaire et tissulaire du substrat ?

Et enfin, comment les stress abiotiques qui compromettent les environnements écologiques en agriculture, tels que la salinité, la sécheresse et la toxicité des métaux lourds, affectent-ils les flux et la dynamique des nutriments des plantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests d’appauvrissement ou d’accumulation de substrat, ou les mesures d’électrodes vibrantes sélectives en fer est que nous sommes en mesure de mesurer des flux unidirectionnels par opposition aux flexions nettes, ce qui est une différence entre l’influx et l’eFlex. Ce faisant, nous sommes en mesure d’obtenir des informations précieuses sur la capacité énergétique, les mécanismes et la régulation des systèmes de transport des nutriments et des substances intoxicantes des plantes.

L’espèce d’orge modèle sera utilisée dans cette expérience, cultivez les semis d’orge en hydroponie pendant sept jours dans une chambre de croissance climatisée un jour avant l’expérimentation, regroupez plusieurs semis pour en faire une seule répétition. Enroulez un morceau de tube tigon de deux centimètres autour de la partie basale des goulottes et fixez le tube avec du ruban adhésif pour créer un collier. Utiliser trois plantes par grappe pour l’analyse d’influx direct ou DI et six plantes par grappe pour l’analyse compartimentale par traceur, flx ou Kate un jour avant l’expérience.

Préparez les matériaux et solutions suivants pour DI : rassemblez les solutions de pré-étiquetage, d’étiquetage et de désorption, les tubes de centrifugation et les flacons d’échantillons, aérez et mélangez toutes les solutions pour Kate. Rassemblez bien ce qui suit. Solutions mixtes d’étiquetage et d’élution aérées, entonnoirs d’efflux, tubes de centrifugation et flacons d’échantillons.

Préparer les traceurs radio le jour de l’expérience en suivant toutes les exigences de la licence de matières radioactives de l’établissement. Porter l’équipement de sécurité et les dosimètres appropriés et utiliser un blindage approprié pour la préparation de l’isotope radioactif du potassium. Potassium 42.

Placez un bécher propre et sec sur la balance et mettez la balance à zéro. Retirez un flacon de traceur de son emballage et versez la poudre dans le bécher. Prenez note de la pipette de masse, 19,93 millilitres d’eau distillée dans le bécher, suivis de 0,07 millilitres d’acide sulfurique.

Ensuite, la concentration de la solution mère radioactive est calculée. Compte tenu de la masse et du poids moléculaire du carbonate de potassium et du volume de la solution, utilisez un compteur Geiger Mueller pour surveiller régulièrement la contamination. L’isotope radioactif de l’azote 13 est produit dans un cyclotron et arrive sous forme liquide pour les mesures DI.

À l’aide d’une pipette de potassium 42, la quantité de solution mère radioactive nécessaire pour atteindre la concentration finale souhaitée de potassium dans la solution de marquage Pour les mesures DI à l’aide d’une pipette d’azote 13, une petite quantité inférieure à 0,5 millilitre de traceur radio dans la solution de marquage. Laissez la solution d’étiquetage se mélanger complètement par aération. Ensuite, pipetez un sous-échantillon d’un millilitre de solution d’étiquetage dans chacun des quatre flacons d’échantillon.

Mesurez l’activité radio dans les flacons à l’aide d’un compteur gamma. Assurez-vous que le compteur est programmé de manière à ce que les comptages par minute ou les lectures CPM soient corrigés. Pour la désintégration isotopique, qui est particulièrement importante pour les traceurs à vie courte, calculer l’activité spécifique de la solution de marquage S non exprimée en nombre par minute par micromole en faisant la moyenne des comptes des quatre échantillons et en divisant par la concentration du substrat en solution, immerger les racines d’orge dans une solution de pré-marquage non radioactive pendant cinq minutes pour pré-équilibrer les plantes dans les conditions d’essai.

Après cela, plongez les racines dans la solution de marquage radioactif pendant cinq minutes. Transférez les racines dans une solution de DESORPTION pendant cinq secondes pour éliminer la majeure partie de l’activité radio adhérente à la surface. Transférez ensuite les racines dans un deuxième bécher de solution de désorption pendant cinq minutes.

Pour éliminer davantage les racines du traceur extracellulaire, disséquez et séparez les pousses, les pousses basales et les racines. Placez les racines dans des tubes à centrifuger et faites tourner les échantillons pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de qualité clinique à basse vitesse. Pour enlever l’eau de surface et interstitielle, pesez les racines pour obtenir le poids frais.

Mesurez la radioactivité dans les échantillons de la plante à l’aide d’un compteur gamma, calculez l’afflux dans la plante à l’aide de cette formule. Commencez cette procédure en préparant la solution d’étiquetage et en mesurant le nœud S comme indiqué précédemment. Après avoir mesuré s, ajoutez 19 millilitres d’eau à chaque échantillon de sorte que le volume final soit égal au volume EIT de 20 millilitres.

Comptez l’activité radio dans chaque échantillon de 20 millilitres. Immergez les racines dans la solution d’étiquetage pendant une heure. Au bout d’une heure, retirez les plantes de la solution d’étiquetage et transférez-les dans l’entonnoir FLX, en vous assurant que tout le matériel racinaire se trouve à l’intérieur de l’entonnoir.

Fixez doucement les plantes sur le côté de l’entonnoir d’efflux en appliquant une petite bande de ruban adhésif sur le collier en plastique Versez doucement le premier elu dans l’entonnoir. Démarrez une minuterie pour compter en secondes, et après 15 secondes, ouvrez le robinet et récupérez l’EIT dans le flacon d’échantillon. Fermez le robinet et versez doucement l’EIT suivant dans l’entonnoir.

De cette manière, collectez l’EIT pour le reste de la série Elucian pour une période totale de 29,5 minutes dans l’UE. Une fois le protocole de l’UE terminé, récoltez les plantes comme indiqué précédemment, comptez l’activité radio dans les EIT et les échantillons de plantes à l’aide du compteur gamma, en multipliant la lecture de chaque EIT par le facteur de dilution Trac de libération en fonction du temps d’élution dans des conditions d’état stationnaire, effectuez des régressions linéaires et des calculs de flux. Demi-mensonges d’échange et tailles de piscine.

On trouvera ci-dessous les isothermes représentatives de l’afflux d’ammoniac en fonction des variations des concentrations externes d’ammoniac. Dans les racines intactes des semis d’orge cultivés à haute teneur en ammoniac ou en ammonium, et les flux d’ammoniac à faible ou à haute teneur en potassium étaient significativement plus élevés à faible teneur en potassium de McKayla. L’analyse des isothermes à Menin révèle qu’un taux élevé de potassium a relativement peu d’effet sur l’affinité du substrat des transporteurs d’absorption de l’ammoniac, mais réduit considérablement la capacité de transport.

Ce résultat suivant met en évidence la plasticité rapide du système d’absorption du potassium. Dans les racines des semis d’orge intacts cultivés à une teneur modérée en potassium et à une teneur élevée en ammonium. Une augmentation de près de 350 % de l’afflux de potassium a été observée dans les cinq minutes suivant le retrait de l’ammonium de la solution externe.

Cet effet de sevrage de l’ammonium était sensible aux inhibiteurs des canaux potassiques, le baryum tétraéthylammonium, un césium. Ces graphiques montrent l’état d’équilibre du potassium 42 efl dans les racines de semis d’orge intacts cultivés à faible teneur en potassium et modérément en nitrate, et les effets immédiats de 10 millimolaires de chlorure de césium, de cinq millimolaires de sulfate de potassium et de cinq millimolaires de sulfate d’ammonium sur flx potassium flx ont été inhibés par le césium ou le potassium, mais stimulés par l’ammonium. Cate peut également être utilisé pour estimer les concentrations et les temps de renouvellement du substrat dans les compartiments subcellulaires.

L’analyse de régression de la phase d’échange lent de la libération du traceur ainsi que de la rétention du traceur dans les tissus végétaux peut révéler des informations importantes sur la taille du pool et les demi-vies d’échange de composants subcellulaires tels que la paroi cellulaire, le cytoplasme et l’AV. Ce tableau montre les paramètres de cape extraits des mesures de potassium à l’état d’équilibre 42 flx dans des semis d’orge cultivés avec un millimolaire de nitrate ou 10 millimolaires d’ammonium. Ce dernier représente un scénario toxique.

Un taux élevé d’ammonium provoque la suppression de tous les flux de potassium et une diminution significative de la taille des bassins. Une fois maîtrisée, l’efficacité de la méthodologie DI peut être améliorée en échelonnant les traitements à 30 secondes d’intervalle. Ce faisant, nous pouvons examiner jusqu’à 10 conditions dans une seule expérience.

De même, plusieurs courses Kate peuvent être effectuées simultanément si l’on dispose d’un temps suffisant entre les courses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les flux de nutriments et de substances intoxicantes dans les plantes intactes à l’aide de traceurs radioactifs.