Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l'ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

cellules souches du cancer (CCM) sont impliqués dans la rechute de la tumeur en raison de la chimiorésistance. Nous avons optimisé un protocole pour la sélection et l'expansion de la CCF de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. En traitant les cellules avec le cisplatine chimiothérapeutique et la mise en culture d'une cellule souche promotion de médias nous enrichir en cultures SCC non adhérentes.

L’objectif global de cette procédure est de sélectionner et d’isoler les cellules souches du cancer de l’ovaire résistantes à la chimiothérapie. Pour ce faire, il faut d’abord marquer par fluorescence les lignées cellulaires du cancer de l’ovaire avec la protéine fluorescente rouge ou RFP et sélectionner les cellules positives pour la RFP à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence ou des faits. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter des lignées cellulaires de cancer de l’ovaire avec du cisplatine chimiothérapeutique pendant 72 heures, puis à cultiver les cellules survivantes dans des milieux CSC.

Après deux jours, les stéroïdes de non-adhérence se formeront. Ensuite, les CSC sont caractérisés à l’aide de l’analyse de l’expression génique des marqueurs de cellules souches et les CSC sont analysés pour les marqueurs de surface cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux. En fin de compte, l’analyse des CSC pour la réponse thérapeutique est réalisée en traitant des cellules avec du cisplatine ou du paclitaxel et en effectuant un test MTT pour mesurer la viabilité.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le traitement des cellules cancéreuses avec de fortes doses de paclitaxel et de cisplatine est que notre méthode produit des cellules plus viables tout en utilisant des quantités moins toxiques d’agents chimiothérapeutiques. Les implications de cette technique s’étendent à l’amélioration du traitement du cancer de l’ovaire, car les CSC représentent une population résistante aux traitements qui aura besoin de nouvelles modalités de traitement. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le cancer du pancréas, le cancer du sein et d’autres types de tumeurs avec des cellules résistantes aux traitements.

Aux côtés de Jennifer, le Dr Leroy, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Pour commencer, propagez Skov 3 et O tousser 4, 2, 9 lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une fluidité comprise entre 40 et 50 %. Pour générer le SCV, trois cellules exprimant la protéine fluorescente rouge ou RFP ajoutent des particules lentivirales exprimant RFP et 10 microgrammes par millilitre de poly cerveau au SCV trois milieux en l’absence de pénicilline et de streptomycine pendant 72 heures.

Après 72 heures, sélectionner les cellules positives à la RFP par tri cellulaire activé par fluorescence ou les faits par d’abord la trypsine RFP et les cellules non exprimant la RFP, puis centrifuger à 125 fois G pendant cinq minutes après la centrifugation remettre les cellules en suspension à 10 millions de cellules par millilitre dans du PBS contenant 0,1 % BSA sur un trieur de cellules. Utilisez des cellules non RFP pour déterminer les paramètres de tri. Ensuite, collectez des cellules qui expriment une RFP élevée à l’aide d’un laser de 561 nanomètres pour enrichir les cellules souches cancéreuses.

Traiter le SCV trois, le SCV trois, le RFP ou la toux O 4, 2, 9 lignées cellulaires avec 20 micromolaires de cisplatine chimiothérapeutique pendant 72 heures. Ensuite, la trypsine est les cellules et les cellules survivantes de la culture dans les milieux CSC. Changez le milieu tous les deux jours en centrifugeant les cellules à 125 fois G pendant cinq minutes et Resus en suspendant la pastille dans un milieu CSC frais pour vérifier la viabilité des cellules tous les deux jours en comptant les cellules et en effectuant l’exclusion du bleu trian.

Prélever les CSC pour d’autres expériences en les centrifugant comme précédemment et en suspendant à nouveau le granulé dans la solution appropriée. Surveille la morphologie des cellules du CSC à l’aide d’un microscope optique à des grossissements de 20 x et 40 x. Pour caractériser les CSC, il faut d’abord prélever trois préparations de CSC en centrifugeant des milieux contenant des cellules à 125 fois G pendant cinq minutes.

Ensuite, mettez la pastille en suspension dans une solution de phénol contenant du thiocyanate d’indium gu. Pour l’extraction de l’ARN, synthétisez ensuite de l’ADN complémentaire ou CD NA de 0,1 à un microgramme d’ARN à l’aide d’un kit de transcription inverse de l’ADNC disponible dans le commerce. Ensuite, effectuez une réaction en chaîne par polymérase quantitative transcrite inversement, abrégée Q-R-T-P-C-R comme détaillé dans le protocole de texte.

Effectuez tous les Q-R-T-P-C-R en double pour chaque échantillon à l’aide d’un thermocycleur PCR en temps réel capable de détecter plusieurs fluorophores. Comme dernière étape, normalisez l’expression des gènes des cellules souches pour écarter l’expression de DH pour chaque échantillon. Utilisation de la méthode delta delta CT

Récoltez les CSC en prélevant des milieux contenant des cellules et en centrifugeant à 125 fois G pendant cinq minutes. Ajoutez 500 microlitres d’une solution de détachement cellulaire non protéolytique pour briser les cellules avant de centrifuger à nouveau pour éliminer la solution de détachement cellulaire. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS froid.

Incuber les cellules dans un milieu de croissance normal pendant une heure avant de marquer les cellules après avoir fait tourner les cellules. Comme précédemment, remettre en suspension les cellules dans du PBS avec 0,1 % de BSA contenant l’anti CD 1 33 PE et l’anti CD 1 17 FE. Ensuite, fixez les cellules pendant la nuit dans du Para formaldéhyde à 1 % et effectuez une cytométrie en flux pour analyser l’expression de surface cellulaire du CD 17 et du CD 1 33. Collectez des données sur les cellules des canaux FL un et FL trois et générez des portes pour les cellules exprimant à la fois les ajustements E et pe.

Générez un diagramme à points avec quatre quadrants et déterminez le nombre de cellules dans chaque plaque de quadrant. 5 000 cellules par puits pour chaque variante de cellule sur des plaques à 96 puits pendant la nuit. Traitez ensuite les cellules avec différentes concentrations de cisplatine ou de paclitaxel pendant 96 heures.

Après 96 heures, ajoutez 10 microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Les MTT incubent à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures jusqu’à ce qu’un précipité se forme pour se solubiliser. MTT. Ajouter le solvant MTT, une solution contenant quatre millimolaires d’acide chlorhydrique et 0,1 % de NP 40 dans de l’isopropanol.

Après une incubation de 15 minutes dans l’obscurité, lire les plaques à 570 nanomètres sur un lecteur de plaques pour démontrer que les CSC ont été isolés à partir de lignées cellulaires épithéliales de cancer de l’ovaire à l’aide d’un traitement au cisplatine. Des images des lignées cellulaires ont été acquises avant le traitement et, après la sélection, la microscopie optique a capturé des images d’observance. SCV trois et OCA 4 2 9 cellules, ainsi que SCV trois CSC et OCA 4 2 9 CSC Les CSC apparaissent ronds et ne se fixent pas aux plaques de culture tissulaire.

SCV : trois cellules transduites avec RFP conservent leur fluorescence après l’isolement des CSC, démontrant ainsi que les cellules sont viables. Viable. Les cultures de CSC ont été évaluées pour leur réponse au traitement médicamenteux. Les CSC ont montré une résistance accrue à l’expression du cisplatine et du paclitaxel des gènes des cellules souches.

CD 1 33 NEIN nano et T four ont été examinés. Dans les premières expériences. T quatre, nano et nein étaient élevés dans les cultures de CSC S SCV trois par rapport aux cultures non traitées, mais les résultats n’étaient pas statistiquement significatifs.

Le CD 1 33 a été induit de manière significative dans les cultures de CSC SCV trois par rapport aux cellules non traitées. En répétant ces expériences, T quatre et nano ont augmenté dans les CSC S SCV trois par rapport aux cellules de contrôle parental. SCV trois, les CSC présentent une expression accrue à la surface cellulaire du marqueur CSC CD 17, comme révélé par l’analyse par télécopieur. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la principale limitation de ce protocole est la durée pendant laquelle les CSC restent viables.

Grâce à ce protocole, le CSC reste viable pendant moins d’une semaine. Par conséquent, les types d’expériences et d’analyses pour les CSC doivent être soigneusement programmés. N’oubliez pas que travailler avec du cisplatine peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de vêtements de protection et l’évitement du contact avec la peau et les muqueuses doivent toujours être prises après cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’exclusion du bleu triam peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la viabilité de la cellule, ainsi que de limiter les tests de dilution pour démontrer les caractéristiques favorisant la tumeur des CSC après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer pour explorer les voies qui mènent à la résistance à la chimiothérapie.