Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant> 6 mois.

L’objectif général de l’expérience suivante est de cultiver du tissu mammaire stérile non perturbé enzymatiquement contenant des zones de carcinome insiductaire ou de lésions CCIS pour engendrer la formation spontanée de sphères de mammo in vitro. Ceci est réalisé en immergeant partiellement de petits morceaux de tissu mammaire contenant des segments canalaires dans un volume minimal de milieu exempt de sérum pour fournir un gradient d’oxygène et de nutriments dans l’organoïde. Ensuite, les organoïdes sont cultivés sans perturbation jusqu’à ce que les cellules épithéliales et les fibroblastes émergent des canaux ouverts et se fixent au ballon de culture tissulaire.

En fin de compte, l’origine épithéliale de la formation spontanée de la mammophile qui en résulte peut être confirmée à la fois par un examen microscopique direct et une coloration par immunofluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui utilisent la dissociation enzymatique du tissu mammaire, est que notre culture d’organoïdes CCIS du sein maintient le contexte biologique du microenvironnement canalaire sans perturber les interactions cellulaires in vivo. Bien que cette méthode puisse fournir des informations uniques sur la biologie du carcinome canalaire mammaire in situ, la deuxième peut également être appliquée à d’autres types de lésions néoplasiques pré-invasives, telles que la néoplasie intra-épithéliale pancréatique ou la néoplasie intra-épithéliale prostatique.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce que les tissus restent stériles pendant le transport entre le bloc opératoire et la zone de traitement des tissus. De plus, les instruments et les réactifs utilisés pour le traitement des tissus doivent être stériles afin d’éviter toute contamination Lors du dégrossage des tissus Avant d’acquérir les échantillons de tissus, désinfectez d’abord la zone de travail avec de l’éthanol à 70 % et ouvrez une paire de gants stériles, en plaçant l’emballage sur la surface de travail. Placez l’intérieur stérile de l’emballage du gant, face vers le haut, puis mettez les gants.

Ensuite, nettoyez la surface du récipient à échantillon avec de l’éthanol à 70 % et retirez la pellicule plastique du récipient. Placez l’échantillon de tissu mammaire sur l’emballage du gant, puis trempez deux cotons-tiges dans le colorant de marquage tissulaire. Roulez les écouvillons sur la surface du tissu pour appliquer le colorant sur le tissu, épongez le tissu teint avec un morceau de gaze imbibée de vinaigre, puis coupez le tissu mammaire en morceaux verticaux d’environ cinq millimètres d’épaisseur sans couper complètement le tissu.

Garder les tissus stériles est la partie la plus importante de la procédure. Pour assurer le succès, il est important d’avoir les cotons-tiges de teinture, le vinaigre de gaze stérile et les lames pour un accès facile afin d’éviter la contamination pendant le traitement des tissus. Palpez maintenant le tissu pour les zones de calcification, en identifiant le CCIS par son aspect pâle ferme caractéristique entouré de bordures caoutchouteuses rougeâtres qui semblent granuleuses en raison des spicules de calcium.

Coupez toutes les zones de calcification, y compris une petite quantité de tissu mammaire environnant. Placez ensuite le tissu dans un tube stérile de 50 millilitres contenant 20 à 30 millilitres de milieu riche en nutriments. Après avoir inversé le tube plusieurs fois pour mélanger le tissu et le milieu, remplacez le surnageant par un milieu frais.

Ensuite, placez le tube dans un récipient isolé et transportez le tissu au laboratoire de culture tissulaire pour cultiver les cellules du tissu mammaire. Versez le tissu et une petite quantité du milieu riche en nutriments dans une boîte de Pétri stérile. Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper le tissu fibreux.

Après avoir jeté les morceaux fibreux, coupez le tissu mammaire en morceaux d’environ trois millimètres carrés, chaque organoïde contenant au moins un segment de canal discernable dans le stroma environnant. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, placez les organoïdes dans un flacon de culture de tissus stériles et ajoutez 11 millilitres de milieu riche en nutriments sans sérum fraîchement préparé. Faites tourner le ballon pour répartir uniformément les organoïdes dans tout le milieu, puis incubez le ballon à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 48 heures.

Le deuxième jour, après l’incubation, placez délicatement le ballon sur une platine de microscope inversé pour vérifier s’il y a une contamination bactérienne ou fongique potentielle, en prenant soin d’éviter les mouvements brusques brusques ou le tourbillon du flacon. Si aucune contamination n’est constatée, remettre le ballon dans l’incubateur pendant une journée supplémentaire. Si une contamination est constatée, jeter le flacon et son contenu dans un contenant approprié le troisième jour après l’incubation.

Placez des millilitres de milieu dans un récipient stérile à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, sans perturber les organoïdes, remplacez le milieu conditionné par le milieu frais préchauffé. Faites pivoter très doucement le ballon pour répartir le fluide sur la surface du ballon, puis replacez le ballon dans l’incubateur.

Une fois que les colonies de cellules organoïdes ont été établies, remplacez le milieu tous les trois jours comme nous venons de le démontrer. Après 10 à 14 jours de culture, jeter tous les morceaux de tissu non adhérents, les mammosphères et les structures 3D surgissent spontanément de plusieurs fragments de tissu de canal CCIS humain indépendant de différents patients diagnostiqués avec une hyperplasie canalaire atypique ou un carcinome canalaire in situ, ni l’extrait de membrane basale sérique ni les matrices gélatineuses ne sont nécessaires pour la formation spontanée de mammos sphere. Les sphères de mammos génèrent également des tumeurs de xénogreffe mammaire dans un modèle de souris à patins NOD avec le même schéma de croissance que celui du cancer invasif.

Ces résultats démontrent que les cellules progénitrices à potentiel invasif préexistent dans le canal CCIS du sein humain, mais qu’elles sont apparemment retenues, contrôlées par la niche canalaire et peuvent être amenées à émerger en culture organoïde. L’origine épithéliale des sphères de mammos et des xénogreffes dérivées des sphères de mammo CCIS peut être confirmée par immunofluorescence. Par exemple, ces images démontrent l’identification de sphères de mammos dans une culture envivo par un anticorps monoclonal de souris réactif à l’epca humain, ainsi qu’au centre d’une xénogreffe de skid NOD.

La sphère de mammos formant des cellules épithéliales néoplasiques dans cette culture représentative a été dérivée de lésions mammaires pré-invasives dépourvues d’invasion de Frank ou de micro-invasion L’examen histopathologique du tissu utilisé pour la culture organoïde a révélé des lésions intracanalaires confluentes avec des limites de membrane basale intactes, suggérant que les sphères de mammo spontanées formées dans ce système de culture n’étaient dérivées que de zones néoplasiques pré-invasives, et n’étaient pas le produit de rares zones de micro-invasion. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de communiquer avec les radiologues, les pathologistes et le personnel de recherche concernant la nécessité de maintenir la stérilité des tissus pendant les études de macroscopie tissulaire ou d’imagerie. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les microréseaux de protéines en phase inverse ou l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires.

Par exemple, on peut se demander quel est le profil moléculaire des différentes populations cellulaires qui émergent spontanément au sein de ce système de culture ? Notre technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique et de la génomique pour explorer l’autophagie, la signalisation calcique et la réparation de l’ADN dans les tissus pré-cancéreux vivants du sein.