Un In Vitro Adult Souris Préparation pour étudier les propriétés de cuisson des afférences musculaires

L’objectif général de cette procédure est d’étudier l’activité du NT du fuseau musculaire in vitro chez une souris adulte. Pour ce faire, il suffit de disséquer d’abord le muscle extenseur des doigts, le muscle le plus long et le nerf périnéal profond et de les placer dans un bain de tissus perfusés. La deuxième étape consiste à fixer le muscle à un contrôleur de force et de longueur et à placer une électrode d’aspiration en verre sur l’extrémité coupée du nerf pour enregistrer l’activité afférente musculaire.

Ensuite, l’ORL enregistré est identifié comme un fuseau musculaire afférent en recherchant une pause dans le tir afférent pendant la contraction de la contraction. La dernière étape consiste à enregistrer les réponses du fuseau musculaire afférent identifié aux étirements de rampe et de maintien. En fin de compte, cette préparation in vitro peut être utilisée pour étudier l’effet d’une perturbation, telle qu’un modèle de maladie, sur les propriétés de réponse afférente du fuseau musculaire.

Le principal avantage d’utiliser la préparation in vitro pour étudier l’afférence du fuseau musculaire est qu’elle vous donne un contrôle précis de l’environnement musculaire et peut éliminer les facteurs de confusion potentiels de l’anesthésie et de l’état de perfusion musculaire. La démonstration de la dissection sera assurée par Rémi Manway, un étudiant de premier cycle du laboratoire, après avoir anesthésié et décapité une souris adulte. Retirez les organes internes et la peau comme décrit dans le protocole textuel.

Ensuite, retirez les jambes en coupant au-dessus des hanches et en plaçant la peau des jambes dans un plat avec une solution saline réfrigérée à faible teneur en calcium et en magnésium. Après avoir disposé les pattes côté dorsal vers le haut dans le plat, placez une aiguille aux deux extrémités d’un pied et une aiguille sur la cuisse antérieure et postérieure. Ensuite, épinglez l’autre pied et les cuisses de la même manière.

Une fois terminés, les articulations du genou et de la cheville sont à un angle de 90 degrés. Ensuite, sous une lunette de dissection, soulevez la couche supérieure du muscle sur les cuisses. Utilisez des ciseaux à ressort gastro Viejo pour faire une coupe médiane.

Pour exposer le nerf sciatique directement en dessous. Le nerf sciatique est situé juste en dessous de la couche musculaire supérieure et passe au-dessus du fémur à partir de sa sortie près des hanches jusqu’à ce qu’il se ramifie dans le nerf périnéal et tibial commun juste avant l’articulation du genou. Retirez ensuite le muscle au-dessus du nerf sciatique pour exposer le point où la branche nerveuse périnéale profonde plonge dans le muscle long fléchisseur du hallis long ou muscle FHL.

À l’aide de la pince numéro 55, disséquez le tissu conjonctif autour de la branche périnéale pour le libérer des muscles gastro et sous, qui se trouvent du côté médial du tibia. Coupez les tendons des muscles gastro et soléaires et retirez-les soigneusement sous le nerf. Ensuite, retirez le muscle superficiel du côté latéral du tibia pour exposer trois faisceaux tendineux distincts au niveau de l’articulation de la cheville, du médial au latéral, du FHL, de l’extenseur des doigts longus ou EDL et du tibias antérieur ou ta.

Notez que l’EDL est caché sous le ta. Coupez maintenant le tendon TA au niveau de l’articulation de la cheville. Soulevez le TA et éloignez-le de l’EDL et coupez le muscle près du genou pour le retirer.

Ensuite, coupez le tendon FHL au niveau de la cheville et soulevez-le vers l’arrière pour atteindre la zone où le nerf entre dans le FHL. Coupez juste en dessous de ce point et retirez environ les deux tiers du muscle FHL à l’aide de grandes ciseaux à ressort. Coupez les tendons EDL aux articulations de la cheville et du genou.

Ensuite, coupez le nerf sciatique aussi près que possible de l’articulation de la hanche et enlevez doucement toutes les branches nerveuses à l’exception de la branche périnéale profonde. Ensuite, à l’aide de ciseaux tranchants, coupez à travers l’os du tibia au niveau du genou et coupez à mi-chemin de la cuisse afin d’enlever l’EDL, le FHL restant et le nerf des tissus environnants. Enfin, coupez l’os du tibia restant de sorte qu’il ne reste que la partie EDL du FHL et le nerf.

Le nerf est assez petit et facile à extraire du muscle. Laisser une partie du muscle FHL vous donne quelque chose à manipuler et aide à protéger l’EDL et le nerf. Le bain de tissu utilisé pour l’expérience est un bain d’une capacité de 25 millilitres disponible dans le commerce.

Deux électrodes de stimulation sont fixées au fond du bain. Il y a un tenon de tissu monté et la quantité pour un contrôleur de force en longueur. Commencez à profoncer dans le bain avec du liquide interstitiel synthétique oxygéné à un débit de 15 à 30 millilitres par minute.

Placez un petit morceau de protection au fond du plat et insérez une épingle à insectes dans le tissu FHL restant pour stabiliser le muscle. Transférez ensuite la préparation du nerf musculaire dans le bain de tissus pour faciliter la fixation du muscle. Dans une étape ultérieure, pliez un petit morceau de fil dans un crochet en forme de JS et utilisez de l’époxy pour le fixer au bras de levier du contrôleur de force et de longueur.

Maintenant, attachez une suture en soie six oh autour de chaque tendon, fixez une suture au tenon tissulaire et l’autre suture au fil en forme de JS du bras de levier. Retirez la goupille anti-insectes et le protège-insectes après avoir attaché les tendons. Ensuite, sélectionnez la micro-électrode d’aspiration en verre avec un diamètre de pointe intérieure de 10 à cent micromètres, et remplissez-la de suffisamment de liquide interstitiel synthétique pour toucher le fil d’argent intérieur.

Aspirez ensuite l’extrémité coupée du nerf dans l’électrode. Ensuite, connectez l’électrode d’aspiration à l’orifice positif d’un amplificateur différentiel. Enveloppez l’électrode avec un fil de chlorure d’argent qui se connecte à l’orifice négatif de l’étage de tête.

Mettez à la terre le bain de profusion en faisant passer un deuxième fil d’argent chlorure du bain à l’orifice de mise à la terre de l’étage principal. De plus, mettez à la terre le tube de profusion sur la cage de Faraday à plusieurs endroits pour atténuer le bruit électrique introduit par les pompes à perfusion. Commencez la stimulation du muscle en montant des électrodes de chaque côté du muscle dans le bain de tissus pour induire une contraction par contraction

Augmentez la tension de stimulation jusqu’à ce qu’une force contractile maximale soit observée, puis augmentez la tension de 15 % supplémentaires pour atteindre une tension supra maximale. Continuez les contractions à la tension maximale SRA avec un repos de dix secondes entre les deux, mais variez la longueur du muscle jusqu’à ce qu’une force contractuelle maximale soit atteinte. Pour trouver la longueur optimale ou le nœud en L du muscle, pour collecter des données à une température autre que la température ambiante.

Placez une sonde de température dans le bain de tissu près du muscle. Augmentez lentement la température du bain en pompant de l’eau chauffée à travers la plaque de base du bain de tissus. Enroulez des coussins chauffants en argile allant au micro-ondes autour du réservoir de liquide interstitiel synthétique pour aider à maintenir une température constante.

À ce stade, attendez une heure pour permettre au tissu d’atteindre la température du bain ou pour que la transmission synaptique normale se rétablisse. Après la dissection dans la solution pauvre en calcium. Pour identifier une afférente comme un fuseau musculaire, l’afférente délivre un stimulus de tension super maximale de 0,5 milliseconde une fois par seconde pour induire des contractions répétées.

Si l’activité neuronale s’interrompt pendant la contraction de la contraction, cela indique que l’enregistrement provient probablement d’une afférence du fuseau. Ensuite, utilisez un logiciel d’acquisition de données pour appliquer des changements de longueur à différentes vitesses et à différentes longueurs. Un script personnalisé est disponible en téléchargement sur le site Web de JO Pour automatiser cette tâche, appliquez des étirements de rampe et de maintien pendant quatre secondes à partir du nœud en L pour étirer le muscle à 2,5 %5 % ou 7,5 % supplémentaires du nœud en L.

Utilisez des vitesses d’étirement de 2040 ou 60 % de nœuds par seconde. À la fin de l’expérience, déterminez la santé musculaire à 24 degrés Celsius à l’aide des contractions isométriques maximales de tetin comme décrit dans le protocole de texte, l’activité neuronale et la tension musculaire de 30 contractions de contraction sont superposées dans cette image. L’activité afférente s’interrompt lors d’une augmentation de la tension induite par la contraction, qui est une réponse caractéristique des ens du fuseau musculaire illustrée ici est l’activité neuronale brute de deux ens pendant une rampe et un étirement de maintien appliqués à l’EDL.

La fonction d’histogramme des pointes du graphique de laboratoire est utilisée pour identifier les pointes comme appartenant à deux ens distincts. L’afférente indiquée en bleu avait une cadence de décharge de base et augmentait sa réponse pendant l’étirement. L’activité RIN en orange n’avait pas d’activité au repos, mais a répondu à l’étirement.

La fréquence de décharge instantanée de l’unité à revêtement bleu présentant une activité à la longueur de repos est illustrée ici. La fréquence de tir instantanée de la plus petite unité recouverte d’orange qui ne se déclenche que pendant l’étirement est illustrée ici. Notez que les deux unités présentent l’adaptation de la fréquence des pointes pendant l’étirement qui est caractéristique du fuseau musculaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer l’activité ENS de la broche à l’aide d’une préparation in vitro. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse du fuseau musculaire ENS à une perturbation telle qu’une blessure ou une maladie. Il peut également être facilement modifié pour étudier d’autres sous-types de muscles sensoriels.