Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la progression des cellules mammaires après la greffe de cellules tumorales dans le coussinet adipeux à mémoire de souris Ceci est accompli en injectant des cellules cancéreuses du sein dans le coussinet adipeux à mémoire d’une souris adulte, puis en mesurant le volume tumoral avec un pied à coulisse à des niveaux de temps prédéterminés. À la fin de l’expérience, la masse et le volume de la tumeur ont été déterminés et le sang et les poumons de l’animal ont été prélevés pour une analyse plus approfondie.

En fin de compte, les macro et micrométastases peuvent être quantifiées respectivement par analyse visuelle et immunohistochimique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’injection sous-cutanée de cellules tumorales est que le site d’injection du coussinet adipeux mammaire imite le site d’origine de la formation de la tumeur mammaire, ce qui donne des résultats plus fiables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer du sein, telles que la tumeur, les suppresseurs, les oncogènes ou les composants du compartiment stromal impliqués dans la progression du cancer.

Un jour avant l’intervention, rasez les souris N-O-D-D-S-C-I-D du quatrième mamelon jusqu’à la ligne médiane et pesez-les pour vérifier que tous les animaux ont des poids à peu près comparables. Le lendemain, lavez une fois une culture cellulaire d’adénocarcinome du sein humain avec du PBS, puis essayez d’aniser les cellules lorsque la plupart des cellules se sont détachées. Éteignez la réaction avec 10 millilitres de sérum contenant du DMEM, puis faites tourner les cellules pendant sept minutes à 1 200 tr/min à température ambiante, lavez la pastille pour éliminer toute trace de sérum, puis remettez la deuxième pastille en suspension dans du PBS.

Après le comptage, aliquote les cellules à 500 000 par 150 microlitres de concentration dans des microtubes de centrifugation stériles sur de la glace. Remplissez ensuite un tube conique de 50 millilitres avec 35 millilitres de PBS et un autre avec 70 % d’éthanol et trempez des cotons-tiges dans chacun. Lorsque tous les outils sont prêts pour chaque animal, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal.

Ensuite, utilisez du ruban adhésif pour retenir doucement une souris anesthésiante sur un coussin chauffant et confirmez la sédation par pincement des orteils. Utilisez un coton-tige imbibé d’éthanol pour nettoyer la zone rasée, puis utilisez une lame de scalpel pour faire une petite incision entre le quatrième mamelon et la ligne médiane. Insérez le coton-tige imbibé de PBS dans l’incision pour faire une poche, puis utilisez une pince à épiler pour exposer un tampon de graisse à mémoire de forme, qui peut être détecté par sa couleur blanche.

Utilisez une autre pince à épiler pour presser le coussinet adipeux à sa base et exposer complètement le tissu. Ensuite, pipetez les cellules de l’adénocarcinome de haut en bas plusieurs fois pour obtenir une solution cellulaire homogène et aspirez doucement 150 microlitres de cellules dans une seringue à insuline. En prenant soin de tenir une seringue horizontalement avec le trou de l’aiguille vers le haut.

Injectez les cellules dans le coussinet adipeux mammaire confirmant une injection réussie par gonflement du tissu. Relâchez ensuite doucement le coussinet adipeux et utilisez une pince à moustiques pour suturer l’incision, en tournant la suture autour de la pince à moustiques dans le sens des aiguilles d’une montre, dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et dans le sens des aiguilles d’une montre pour faire trois nœuds. Après l’opération, injectez un analgésique et placez chaque animal en position couchée sternale dans une cage individuelle, en surveillant les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.

Huit semaines après l’implantation cellulaire, les souris sont préparées pour le prélèvement d’organes. Fixez l’animal à une base en mousse et utilisez des pieds à coulisse pour mesurer le volume de la tumeur. Ensuite, faites une longue incision verticale sur la ligne médiane, puis faites deux incisions horizontales juste en dessous de la jambe avant et au-dessus de la jambe arrière.

Épinglez la peau à la mousse pour exposer la tumeur, puis utilisez des ciseaux pour dissocier la tumeur de la peau. Ensuite, retirez doucement les poumons, en plaçant le poumon gauche dans la solution de Bowen pendant trois jours, après quoi ce métastatique superficiel deviendra clairement visible à l’œil nu, gelez une partie du tissu dans de l’azote liquide pour isoler ultérieurement l’ARN et placez la partie restante de la tumeur dans l’un des tubes coniques remplis de formine. Ensuite, après le sacrifice de l’animal par ponction cardiaque, l’échantillon de sang de 450 microlitres a été distribué dans un microtube à centrifuger contenant 50 microlitres de citrate de sodium à 3,2 %, puis a fait tourner les globules rouges et stocké les échantillons de plasma à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que des erreurs expérimentales ultérieures telles qu’une inoculation imprécise des cellules ou une fuite puissent entraîner des variations de la taille de la tumeur ou même l’absence d’une tumeur conduisant à la formation d’une structure qui semble similaire à la mémoire.

Coussinet graisseux injecté avec tampon de contrôle. Le taux de croissance de la tumeur dépend également de la nature de la lignée cellulaire injectée et, en général, peut être observé à travers la peau de la souris. De plus, la zone autour de la tumeur peut présenter de gros vaisseaux qui résultent d’un remodelage vasculaire et qui peuvent jouer un rôle crucial dans l’élimination des déchets et l’approvisionnement du tissu tumoral en nutriments et en oxygène.

Contrairement aux expériences in vitro, le taux de croissance des cellules tumorales peut ne pas être constant dans le temps in vivo en raison de l’hypoxie et d’un manque de nutriments. Des zones nécrotiques peuvent se former dans les tissus environnants, et ces zones affecteront le taux de croissance de la tumeur. De plus, les cellules injectées exprimant des gènes d’intérêt spécifiques peuvent avoir un impact sur la progression du cancer, car les gènes peuvent induire une croissance tumorale qui commence rapidement, mais ralentit à la fin ou vice versa.

La collecte des poumons dans la solution de Bowen aide à visualiser les foyers métastatiques superficiels, qui apparaissent sous forme de formations pâles surélevées à la surface du tissu pulmonaire. La formation des foyers dépend de la lignée cellulaire. Les cellules non agressives peuvent donner lieu à des micrométastases uniquement, qui peuvent être facilement identifiées par la coloration h et e sur le tissu pulmonaire inclus dans la paraffine.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme Eliza peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires telles que comment la croissance de la tumeur expérimentale affecte-t-elle les niveaux de cytokines ou de molécules pro-angiogéniques dans le plasma.